基质内注射的脂肪来源间充质干细胞的命运及其对角膜神经再生的影响：一项体内共聚焦显微镜研究

《Experimental Eye Research》：Fate of Intrastromal Injected Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cell and Its Effects on Corneal Nerve Regeneration: An In Vivo Confocal Microscopy Study

AD-MSCs经角膜基质注射后促进神经再生，加速角膜修复，并分泌神经滋养因子。通过IVCM和TUNEL染色证实其促进神经再生效果优于对照组。

　　

蔡佳颖|杨尚志|黄伟伦|侯一婷|弗拉德连·克洛奇科夫|陈美云|廖书朗|陈伟立

台湾新北市辅仁天主教大学医院眼科

摘要

角膜神经损伤会降低角膜敏感性并影响眼表健康。本研究探讨了脂肪源性间充质干细胞（AD-MSCs）在角膜基质内注射后的命运，并评估了它们对兔角膜神经损伤模型中神经再生的影响。首先通过免疫细胞化学染色（IHC）对AD-MSCs的表面标记物进行了鉴定，并通过三系分化和神经分化实验验证了其多能性。这些细胞表达CD73、CD90和CD105，能够成功分化为软骨细胞、骨细胞、脂肪细胞和神经细胞。通过上皮清创建立了兔角膜神经损伤模型。基于体内共聚焦显微镜（IVCM）和H&E染色，发现注射后3天内AD-MSCs仍存在于角膜中央。TUNEL染色显示注射后0小时就已有细胞发生凋亡，表明尽管细胞残余物持续存在数天，但凋亡过程非常迅速。从注射后0小时到第3天，在基质中检测到了MSC标记物（CD73、CD90、CD105）和NGF；第28天时上皮层也检测到了NGF。AD-MSC处理组与对照组之间的上皮伤口愈合情况没有差异。然而，AD-MSC注射加速了角膜神经再生，通过IVCM评估，AD-MSC组在第14天的恢复情况优于对照组（对照组为第21天）。神经元标记物（SMI-312、βIII-微管蛋白）的免疫组化进一步证实了基底神经再生的增强。此外，AD-MSC培养基中含有较高水平的神经营养因子。这些发现表明AD-MSCs能够促进角膜神经再生，可能成为治疗与角膜神经损伤相关的眼表疾病的有效策略。

章节摘录

引言

角膜神经在维持角膜生理功能和眼表完整性方面起着关键作用。从解剖学上看，这些神经起源于三叉神经的眼支，呈放射状进入角膜，形成密集的基底神经丛（Al-Aqaba等，2010；Marfurt等，2010；Patel和McGhee，2005）。角膜神经负责提供感觉神经支配，并介导对泪液生成和眨眼反射至关重要的反射（Eguchi等，2017）；

化学试剂和抗体

牛血清白蛋白、山羊血清、Triton X-100、二甲基亚砜（DMSO）、4′,6-二氨基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）和福尔马林均购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）；4%多聚甲醛购自EMS（美国宾夕法尼亚州哈特菲尔德）。Alpha-MEM、DMEM/F12、TrypLE Express、I型胶原酶、抗生素-抗真菌剂、Alexa Fluor 488以及594荧光染料标记的二级抗体（A11039和A11005）购自Thermo Fisher Scientific（美国沃尔瑟姆）。

AD-MSC细胞系鉴定

根据国际细胞治疗学会（ISCT）的标准，AD-MSCs必须具有贴壁能力、表达特定标记物，并能分化为骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞，以避免表型改变并提高实验重复性（Dominici等，2006）。为了验证AD-MSC细胞系的真实性，我们首先检测了第五代细胞中MSC特异性表面标记物（CD73+、CD90+和CD105+）的表达情况。结果符合预期。

讨论

本研究的目的是探讨脂肪源性间充质干细胞（AD-MSCs）在角膜基质内注射后的命运，并利用体内共聚焦显微镜评估它们对兔角膜神经损伤模型中神经再生的影响。通过特定的MSC标记物（CD73+、CD90+和CD105+）及三系分化（软骨细胞、骨细胞和脂肪细胞）验证了所使用的AD-MSCs的多能性。

作者贡献声明

蔡佳颖：撰写初稿、研究设计、资金获取、数据管理、概念构思。侯一婷：撰写、审稿与编辑、研究。黄伟伦：撰写、审稿与编辑、数据分析、数据管理。杨尚志：撰写、审稿与编辑、研究设计、数据分析、数据管理、概念构思。陈伟立：撰写、审稿与编辑、指导、资金获取、数据分析、概念构思。廖书朗：撰写、审稿与编辑。

未引用文献

Chen等，2000；Dartt，2009；Guo等，2017；Huang等，2021；Lavorato等，2021；Madduri等，2010；Medeiros和Santhiago，2020；Mertsch等，2019；Salehpour等，2024；Soleimani等，2023；Wilkin等，2009。

写作过程中使用生成式AI和AI辅助技术的声明

本文于2024年5月15日至6月3日期间使用了生成式AI（GTP-4o）进行编辑。使用该工具后，作者对内容进行了必要的审阅和修改，并对最终发表的文章内容负全责。

资金来源

本研究得到了中华人民共和国（台湾）科技部（编号110-2314-B-002-224-MY3、111-2314-B-002-185-、NSC-111-2221-E-030-015-）、国立台湾大学（编号111-S0149、112-UN0065）以及辅仁天主教大学医院（编号PL202108009V）的支持。

利益冲突声明

作者声明没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。作者声明以下财务利益/个人关系可能被视为潜在的利益冲突：陈伟立表示获得了科技部的财政支持；如果还有其他作者，他们也声明没有已知的财务利益或个人关系。

致谢

作者感谢国立台湾大学医院医学研究部第二核心实验室的Ting Chen和Ning Hsu在研究期间提供的技术支持。本文使用了生成式AI（GTP-4o）进行编辑。支持本研究结果的数据可向通讯作者WLC索取。