《American Journal of Transplantation》：Allograft and Recipient Tissue Injury during Cardiac Allograft Rejection: Evidence from Cell-free DNA
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本研究为解答心脏移植物排斥反应（AR）是否引发受体系统性组织损伤这一临床难题，通过血浆游离DNA（cfDNA）的遗传与表观遗传特征分析，量化了排斥期间供体与受体来源的cfDNA水平及组织来源。结果表明，AR时受体cfDNA显著升高，主要源于免疫细胞、血管内皮、肝细胞及肾上皮细胞，并与器官功能障碍的传统生物标志物相关；细胞模型进一步揭示AR来源的cfDNA具有更强的损伤相关分子模式（DAMP）活性。这提示AR不仅是移植物疾病，更与受体多器官损伤风险相关，为AR的监测与管理提供了新视角。
心脏移植是终末期心力衰竭患者的重要治疗手段，但移植物排斥反应（Allograft Rejection， AR）仍是移植后长期存活的主要障碍。传统上，AR被视作一种局限于移植心脏的疾病，临床监测与治疗也主要围绕移植物本身展开。然而，越来越多的线索提示，排斥反应可能不仅仅伤害那颗“新心脏”，还会波及其他器官。比如在肾移植中，排斥反应已被发现与受体其他器官并发症风险增加相关，且伴随全身性炎症因子升高。这些炎症因子在心脏AR时同样会飙升，而它们正是推动全身组织损伤的“催化剂”。那么，心脏AR是否会像在肾脏中观察到的那样，导致受体自身的器官受伤呢？这个问题长期以来并不明确，却是一个公认的导致患者生存率降低的风险因素。搞清楚排斥反应期间受体究竟哪些组织受到了损伤、损伤程度如何，对于更全面地理解AR、实现更有效的监测乃至改善患者预后，都至关重要。
近期，一种名为细胞游离DNA（Cell-free DNA， cfDNA）的分子进入了研究者的视野。cfDNA是细胞损伤或死亡后释放到血液中的DNA片段，已成为包括移植排斥反应在内的多种组织损伤的早期生物标志物。更有趣的是，创新的cfDNA表观遗传学分析技术，能够像“分子溯源”一样，通过检测DNA上特定的甲基化修饰（一种不改变DNA序列但可影响基因表达的化学标记），来量化这些cfDNA究竟来自心脏、肝脏、肾脏还是免疫细胞等特定组织。这为无创、精准地绘制排斥反应期间的“受体损伤图谱”提供了可能。
发表于《American Journal of Transplantation》的这项研究，正是利用这一前沿技术，试图回答上述核心问题。研究团队假设：心脏AR与受体组织损伤相关，这种损伤可通过血浆cfDNA水平来反映。他们开展了一项病例对照研究，系统比较了发生AR的心脏移植受者与移植后状态稳定（Stable）的受者之间，cfDNA水平与来源的差异。
为了完成这项研究，作者主要运用了以下几项关键技术：1. 液滴数字PCR：用于绝对定量血浆中的总核cfDNA（n-cfDNA）、线粒体cfDNA（mt-cfDNA）、供体来源cfDNA（dd-cfDNA）及受体来源cfDNA（rd-cfDNA）。2. 全基因组亚硫酸氢盐测序：这是核心的表观遗传学分析技术，通过检测DNA甲基化模式，来对cfDNA进行组织溯源，量化来自心脏、血管内皮、肝、肾、免疫细胞等数十种特定细胞或组织的cfDNA含量。3. 体外细胞培养模型：将分离自患者血浆的cfDNA与中性粒细胞、肺微血管内皮细胞、肝细胞、肾近端小管细胞等共培养，评估其作为损伤相关分子模式（DAMP）诱导活性氧（ROS）产生、炎症因子释放和细胞损伤的能力。研究所用样本来源于GRAfT（移植基因组研究联盟）研究队列的心脏移植受者。
研究结果丰富而具有启发性，以下结合各部分小标题进行归纳：
3.1. 研究人群
研究共分析了498份血浆样本，包括52名AR患者的280份样本、24名稳定对照患者的200份样本以及18名健康对照者的样本。AR患者与稳定对照者在人口统计学特征、免疫抑制方案及他克莫司血药谷浓度方面具有可比性。
3.2. AR与受体来源cfDNA升高相关
分析发现，与稳定对照组相比，AR患者不仅供体来源cfDNA（dd-cfDNA）显著升高（已知的移植物损伤标志），其受体来源cfDNA（rd-cfDNA）水平也高出约3倍。这种升高与心内膜心肌活检（EMB）所判定的AR严重程度分级呈正相关。纵向分析显示，在部分患者中，rd-cfDNA和dd-cfDNA在AR诊断前就开始上升，诊断时达到峰值，治疗后下降。
3.3. AR显示出与稳定对照不同的cfDNA组织来源谱
通过甲基化溯源分析，揭示了受体损伤的“细胞地图”。AR患者的cfDNA不仅总量高，其构成也独具特征：
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免疫细胞来源：AR患者先天免疫细胞（中性粒细胞、单核/巨噬细胞、自然杀伤细胞）来源的cfDNA水平显著高于稳定对照。
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非造血组织来源：AR患者血管内皮、肾脏、肝脏、呼吸道上皮、胰腺等非造血组织来源的cfDNA水平也显著更高。值得注意的是，通过甲基化特征也检测到了心肌细胞来源cfDNA的升高。
3.4. 组织特异性cfDNA水平与器官损伤临床标志物相关
研究者将cfDNA这一新型生物标志物与传统临床检验指标进行了关联分析，以验证其临床相关性。例如，肝细胞来源的cfDNA水平与肝功能指标AST和ALT显著正相关；在AR诊断时，患者的AST、ALT及肌酐（反映肾功能的指标）水平也显著高于稳定对照。AR事件伴随肝功能障碍（ALT/AST异常）和肾功能异常（肌酐>1.5 mg/dL）的发生率更高。尽管肾脏来源cfDNA与肌酐水平的总体相关性不强，但拥有最高肾脏来源cfDNA的AR事件，同时也记录了最高的肌酐峰值。
3.5. AR来源的cfDNA在培养模型中显示出高DAMP效应
既然心脏血流动力学参数在AR与稳定对照间基本相似，那么高受体损伤的机制是什么？研究者将目光投向了cfDNA的潜在致病角色。体外实验表明，与来自稳定对照或健康人的cfDNA相比，从AR患者血浆中分离出的cfDNA，在多种细胞（中性粒细胞、肺微血管内皮细胞、肝细胞、肾小管细胞）培养中，能诱导更强的损伤相关分子模式效应，表现为更高的线粒体活性氧（mtROS）产生、更多的炎症细胞因子（如IL-6, IL-8, IL-15, IL-1β等）释放以及更高的培养上清中cfDNA水平（提示细胞损伤）。当用DNase I（一种DNA消化酶）处理AR来源的cfDNA后，这些促炎和损伤效应被显著削弱。
综上所述，这项概念验证研究得出以下核心结论：
- 1.
心脏移植物排斥反应（AR）不仅导致移植物损伤（dd-cfDNA升高），还伴随显著的受体系统性组织损伤（rd-cfDNA升高）。
- 2.
受体损伤具有特定模式：损伤主要涉及先天免疫细胞、血管内皮、肝脏、肾脏等器官的细胞，这些也正是心脏移植后常见并发症累及的部位，增强了发现的生物学合理性。
- 3.
cfDNA可作为连接AR与受体损伤的机制性环节：AR期间释放的cfDNA本身可能扮演“损伤警报分子”（DAMP）的角色，通过诱导氧化应激和炎症，形成一个正反馈循环，加剧移植物和受体组织的损伤。
- 4.
临床意义深远：研究提示，监测受体来源cfDNA（rd-cfDNA）有望为AR提供更全面的损伤评估，不仅辅助诊断和分级，还能揭示个体化、持续性的器官损伤风险，有助于在排斥事件后识别哪些患者需要更密切的随访和针对性管理，以改善其长期预后。同时，针对cfDNA-DAMP通路的干预，可能成为未来保护受体器官的新策略。
因此，这项研究突破了将AR视为单纯移植物疾病的传统观念，首次通过高通量cfDNA图谱无创地揭示了排斥反应期间受体“隐秘的伤痕”，为理解心脏移植排斥的全身性影响、开发新的监测与管理工具开辟了新路径。当然，作者也指出，这仍是一项初步研究，需要在更大规模队列和更长随访时间中进一步验证，并深入探索其背后的分子机制（如TLR-9、炎性体、STING通路等）。
