《American Journal of Transplantation》：ADAR1 and RIPK1 orchestrate the ZBP1-mediated PANoptosis and mouse heart transplant rejection
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心脏移植术后，缺血再灌注损伤和免疫排斥导致细胞死亡是移植物损伤和功能丧失的关键原因，但目前缺乏有效干预策略。为解决此问题，研究人员围绕新型程序性细胞死亡形式PANoptosis，深入探究了Z-DNA/ZBP1信号通路在其中的核心作用及调控机制。研究表明，ADAR1与RIPK1以时间依赖方式调控ZBP1-RIPK3复合体激活，进而驱动PANoptosis；ZBP1缺失可显著抑制移植物PANoptosis，减轻急慢性损伤并诱导长期存活。该研究揭示了移植损伤的新机制，为靶向多重细胞死亡通路以改善移植预后提供了全新治疗思路。
心脏移植是挽救终末期心力衰竭患者生命的最终手段，但这条路并非坦途。移植后的心脏，一方面要承受手术本身带来的缺血与再灌注打击，另一方面还要面对受体免疫系统的“排异”攻击。这些损伤最终导致移植心脏的细胞大量死亡，引发移植物功能不全、冠状动脉血管病变，乃至最终的移植物失功。尽管免疫抑制剂的应用已极大改善了患者预后，但如何有效遏制移植术后的早期损伤和慢性排斥，延长移植物寿命，仍是临床面临的严峻挑战。近年来，一种被称为PANoptosis的新型程序性细胞死亡模式进入科学家视野。它并非单一的死亡途径，而是巧妙地整合了细胞焦亡(pyroptosis)、凋亡(apoptosis)和坏死性凋亡(necroptosis)的关键特征，如同一个“死亡综合体”，可能在组织损伤中扮演着更强大、更难被单一手段抑制的角色。然而，PANoptosis在心脏移植这一特定场景中是否被激活、如何被调控、又能否成为干预的新靶点，此前均属未知。与此同时，细胞损伤后释放到循环中的游离DNA(cfDNA)，尤其是其中一种结构独特的左旋Z-DNA，被发现在炎症和细胞死亡中起作用。它能否被特定的传感器识别，进而点燃PANoptosis的“导火索”？为了回答这些关键问题，由Haitao Lu、Jifu Jiang、Xuyan Huang、Tianqing Peng、Aaron Haig、Anthony M. Jevnikar、Lakshman Gunaratnam、Zhu-Xu Zhang组成的研究团队，在《American Journal of Transplantation》上发表了一项重要研究，系统阐明了Z-DNA传感器ZBP1在驱动心脏移植后PANoptosis和移植物损伤中的核心作用，并揭示了ADAR1和RIPK1对这一过程的精细时空调控。
研究者综合运用了分子细胞生物学、生物化学及动物模型等多种技术手段。在细胞水平，使用人微血管内皮细胞(HVECs)构建了cfDNA诱导的细胞死亡模型，并利用小干扰RNA(siRNA)或短发夹RNA(shRNA)进行基因沉默。在动物水平，建立了同种异基因小鼠心脏移植模型（野生型C57BL/6或ZBP1基因敲除小鼠作为供体，BALB/c小鼠作为受体）。关键实验技术包括：酶联免疫吸附试验(ELISA)和圆二色谱(CD)检测Z-DNA；蛋白质免疫印迹(Western blot)分析细胞死亡通路关键蛋白（如caspase家族、GSDMD、p-MLKL、RIPK1/3等）的表达与活化；免疫共沉淀(Co-IP)验证蛋白质间相互作用；免疫组织化学(IHC)和免疫荧光染色分析组织切片中靶分子表达与定位；流式细胞术分析浸润免疫细胞及抗体反应；以及组织病理学评分评估移植物损伤。
3.1. Z-DNA促进ZBP1介导的PANoptosis
研究人员首先发现，在诱导人微血管内皮细胞死亡后，其上清cfDNA中可检测到显著水平的Z-DNA。同样，在小鼠心脏移植术后第3天，受体血清cfDNA中的Z-DNA也显著增加。接着，他们证明cfDNA处理能上调内皮细胞中ZBP1的表达，而沉默ZBP1则可显著挽救由cfDNA诱导的细胞死亡，并且观察到Z-DNA与ZBP1在细胞内的共定位。这些结果说明cfDNA通过ZBP1促进细胞死亡。进一步研究发现，使用针对焦亡、凋亡和坏死性凋亡的特异性抑制剂（Disulfiram、Z-VAD、NSA）单独处理，只能部分减少细胞死亡，而三者联用则能几乎完全阻断，且去除cfDNA中的Z-DNA后则不再诱导死亡，这提示存在多重细胞死亡机制的共同激活，即PANoptosis。蛋白质免疫印迹分析证实，cfDNA处理同时增加了焦亡标志物（cleaved caspase-1/4/5, cleaved GSDMD）、凋亡标志物（cleaved caspase-3/7/8/9）和坏死性凋亡标志物（p-MLKL）的水平，而沉默ZBP1能抑制所有这些通路的活化。因此，Z-DNA通过ZBP1诱导内皮细胞发生PANoptosis。
3.2. ADAR1和RIPK3调控ZBP1介导的PANoptosis
ADAR1是另一个拥有Zα结构域、可识别Z-DNA的蛋白。研究发现，沉默ADAR1会加剧cfDNA诱导的细胞死亡，而沉默RIPK3则能减少细胞死亡。在机制上，ADAR1缺失会上调PANoptosis各通路标志蛋白（cleaved GSDMD、活化caspases、p-MLKL），而沉默ZBP1或RIPK3则抑制这些变化。这表明ADAR1抑制、而RIPK3促进ZBP1介导的PANoptosis。
3.3. ADAR1限制ZBP1表达及ZBP1-RIPK3复合物的组装
通过时间进程分析，研究人员发现ADAR1在cfDNA刺激早期（30分钟）表达达到峰值，随后下降，而ZBP1的表达则在后期逐渐升高。使用ADAR1抑制剂8-AZA可降低ADAR1水平并促进ZBP1表达。免疫共沉淀实验显示，在细胞死亡早期，ADAR1与ZBP1紧密结合，而此时ZBP1与RIPK3的相互作用很弱。随着时间推移，ADAR1水平下降，其与ZBP1的结合减少，而ZBP1与RIPK3的复合物组装则显著增强。沉默ADAR1会导致ZBP1与RIPK3的结合增加，并伴有RIPK3磷酸化(p-RIPK3)的早期增强。因此，ADAR1在早期通过竞争性结合抑制ZBP1的活性，从而限制ZBP1-RIPK3死亡复合物的形成。
3.4. RIPK1激活RIPK3并促进ZBP1与RIPK3的相互作用以驱动PANoptosis
研究表明，在cfDNA处理的早期（3小时内），RIPK1被激活（p-RIPK1），并与RIPK3发生强相互作用，而此时ZBP1与RIPK3的相互作用很弱。RIPK1的激活不依赖于ZBP1，但可能由cfDNA上调的TNFR1或TLR3所介导。到后期（6小时），随着ADAR1的抑制解除，ZBP1与RIPK3的相互作用才显著增强。使用RIPK1抑制剂Nec-1s可降低p-RIPK1和p-RIPK3水平。这些数据表明，在PANoptosis过程中，RIPK1在早期率先激活RIPK3，随后活化的RIPK3再与ZBP1结合，共同驱动细胞死亡进程。
3.5. 移植损伤促进移植物内Z-DNA、ZBP1、ADAR1及PANoptosis
在体实验证实了上述发现。小鼠心脏移植后第3天，移植物内Z-DNA、ZBP1表达显著上调。有趣的是，在ZBP1基因敲除(ZBP1-/-)的移植物中，ADAR1的表达反而更高，这支持了ADAR1对ZBP1的负向调控关系。更重要的是，与野生型移植物相比，ZBP1-/-移植物中PANoptosis的各项标志物（活化的caspase-1/11、cleaved GSDMD/E、p-MLKL）均显著降低。多色免疫荧光染色显示，p-MLKL（坏死性凋亡）、活化caspase-3（凋亡）和cleaved GSDMD（焦亡）可共存于同一细胞，直观证明了PANoptosis在移植心脏中的发生。
3.6. 移植物ZBP1缺陷减轻急性损伤并诱导长期移植存活
最后，研究评估了ZBP1缺失对移植结局的影响。术后第3天，ZBP1-/-移植物表现出更少的细胞死亡（TUNEL阳性减少）、更轻的淋巴细胞浸润（CD3+, CD45+细胞减少）以及更轻的组织病理学损伤。在慢性期（术后25天），ZBP1-/-移植物血管内膜增生更轻，CD3+T细胞浸润和IgG沉积更少，调节性T细胞(FoxP3+)浸润更多，总体损伤评分更低。流式分析进一步显示，ZBP1-/-移植物内浸润的CD45+CD3+T细胞更少，受体脾脏CD8+T细胞对供体的增殖反应及血清中抗供体IgG/IgM水平也更低。最终，生存分析表明，ZBP1-/-心脏移植物存活时间（平均128.5天）极显著地长于野生型移植物（平均28.8天）。
该研究的结论与讨论部分高度概括了其核心发现与重要意义。首先，研究证实移植损伤中释放的Z-DNA是激活PANoptosis的关键分子，其通过传感器ZBP1驱动内皮细胞发生整合了焦亡、凋亡和坏死性凋亡特征的综合性死亡。这为理解移植后组织损伤提供了一个全新的机制视角。其次，研究深入剖析了调控这一过程的精密“开关”：ADAR1在早期充当“刹车”，通过竞争性结合抑制ZBP1功能；而RIPK1则充当早期“油门”，先于ZBP1激活RIPK3，为后续死亡复合物的形成奠定基础。二者以时间依赖的方式协同“编排”了ZBP1-RIPK3死亡复合体的激活进程。最具转化价值的是，体内实验明确证明，靶向这一通路的上游关键节点——敲除ZBP1，能够有效遏制移植物内的PANoptosis，从而大幅减轻急慢性免疫损伤，并最终诱导移植心脏获得长期存活。这强烈提示，ZBP1及其配体Z-DNA是干预心脏移植损伤的极具潜力的新靶点。当前，针对单一细胞死亡通路的疗法在应对复杂的PANoptosis时往往力有不逮。因此，本研究提出的靶向ZBP1以同时调控多条死亡通路的策略，为开发改善心脏移植乃至其他缺血炎症相关疾病预后的全新疗法提供了重要的理论依据和方向。
