《ACS Measurement Science Au》：Integrated iPRISM Direct-on-Urine Platform for Rapid UTI Diagnosis in a Double-Blind Clinical Trial
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这篇研究报道了一种创新的即时检测（POC）平台——集成式iPRISM，该平台可直接在未经处理的尿液样本上，于90分钟内同步完成尿路感染（UTI）筛查和表型药敏测试（AST）。在双盲临床试验中，该技术展现出快速、准确的诊断性能，为优化抗生素管理、实现个体化治疗提供了有力工具。
绪论
尿路感染是全球最常见的细菌感染之一，每年病例超过4亿，造成巨大的健康和经济负担。日益严重的抗菌素耐药性问题，凸显了对快速、准确诊断工具的迫切需求，以支持临床决策和个体化抗菌治疗。世界卫生组织已将改进诊断列为全球抗菌素耐药性研究议程的关键优先事项。
目前，UTI诊断的金标准方法仍严重依赖基于培养的技术，这些方法耗时且劳动密集，通常需要数天才能提供结果，并且诊断准确性常因检测阈值变化和需要专家解释而受限。此外，标准的尿培养常常会漏掉一些生长要求苛刻或不常见的尿路病原体。这些局限性延迟了明确诊断，并使早期临床决策变得复杂。临床工作流程中随后的一个关键步骤是抗菌药物敏感性试验，它指导有效抗生素的选择并支持抗菌药物管理。这一步骤通常需要额外的8至24小时，进一步推迟了治疗决策。近期的一项研究揭示，包括大肠杆菌和金黄色葡萄球菌在内的人类病原体，在达到稳定期时，其宿主获得的表现型记忆会被清除，这引发了人们对传统AST方案可靠性的担忧。与此同时，在UTI管理中，不恰当的抗生素处方仍然是一个主要问题。所有这些因素都强调了对快速、无需培养且可直接用于样本的诊断工具的迫切需求。
尽管已在开发直接尿液诊断技术方面取得了显著进展，目前有超过30个诊断平台处于研究或商业化的不同阶段，但大多数技术仅部分解决了临床工作流程，且临床试验转化有限。尽管用于细菌检测和AST的传感器和生物传感器技术取得了重大进步，但能够同时执行这两种功能的完全集成平台仍然有限。因此，一种能够在未经处理的临床尿液上直接运行，并在严格的双盲现场研究中展示可靠性能的平台，将具有相当大的价值。
研究方法
本研究基于先前概念验证工作，报告了一个简化的集成平台，该平台可同时对疑似感染的新鲜尿液样本进行感染筛查和AST。iPRISM是一种实时光学传感技术，通过监测微生物在微结构硅光子芯片上的生长动力学来检测微生物感染。该方法依赖于图案化的硅光栅，既能促进微生物捕获，又可作为集成光学传感器。当微生物在不同抗菌药物浓度存在下，在硅微结构中定殖和增殖时，它们的存在会调制反射干涉信号，从而实现对暴露于抗菌剂下的生长进行实时、无标记量化，并直接分类易感性表型。
在本研究中，iPRISM直接应用于新鲜采集、未经处理的人体尿液，从而消除了预处理步骤，缩短了周转时间，并将UTI筛查和AST集成到一个检测中。最重要的是，我们开展了一项双盲、现场、贴近患者的临床试验，将我们的快速UTI诊断和AST技术与标准诊断程序进行比较。这种方法遵循既定的抗生素折点浓度，旨在在POC提供快速、准确且具有临床指导意义的UTI诊断。
实验部分详细介绍了所用材料、溶液和培养基的制备、iPRISM设备的制造、iPRISM测定流程、电子显微镜观察以及统计分析。临床尿液样本来自Bnai Zion医疗中心的住院患者，所有临床测试均由临床微生物学实验室的认证技术人员进行，感染诊断采用金标准尿液培养方法。iPRISM分析中，将尿液样本与脑心浸液肉汤按1:1体积比混合（含或不含抗菌药物），然后引入iPRISM设备的通道中。设备保持在37°C，连续收集原始光谱，并使用快速傅里叶变换分析提取信息，最终计算出与细菌生长相关的-ΔI (%)值。
iPRISM平台概览与研究设计
本研究将iPRISM系统推进到可直接从未经处理的尿液样本中同时进行病原体检测和AST。图1a概述了集成iPRISM测定的概念，其中微结构硅光子芯片将微生物定殖和生长动力学转换为实时光学干涉信号，从而支持感染筛查和易感性分析。为展示其用于UTI诊断的性能，iPRISM系统被部署在Bnai Zion医疗中心泌尿科进行了一项前瞻性双盲研究。这种贴近患者的床边POC测试最大限度地减少了与尿液运输相关的分析前变异。同时，入组样本也由医院的微生物实验室使用尿液培养、病原体鉴定和AST的标准多步骤工作流程进行独立分析，这通常需要3到7天才能完成（图1b）。
iPRISM测定的核心是经过化学功能化的微图案硅芯片，旨在促进微生物从测试悬浮液中非特异性捕获，从而使微生物能够在硅表面定殖和增殖。硅芯片设计可容纳广泛的细菌种类，具有周期性的方形孔阵列。为了启动测定，将尿液标本与含有或不含抗生素的BHI肉汤以1:1的体积比混合，然后加载到iPRISM微流控通道中。最终抗生素浓度对应于为大肠杆菌预先建立的折点浓度。在测定过程中，微流控装置保持在37°C，并连续收集原始光谱。
为了将微生物在微图案化光子硅芯片上的活性与阳性检测信号相关联，时间分辨的光学变化表示为-ΔI (%)，这反映了由于微生物存在而导致的光强度随时间下降。在这个集成测定中，在整个观察期间保持恒定的光学信号表明没有尿路病原体（图1a-i），而存在活性病原体则通过-ΔI (%)值的增加来检测，反映了微生物在图案化硅表面的定殖和增殖（图1a-ii，iii中的粉红色迹线）。当易感病原体遇到有效的抗菌药物时，生长抑制导致-ΔI (%)值的增加较小（图1a-ii）。相反，在抗菌药物耐药的情况下，微生物增殖持续，导致光学信号强度不变（图1a-iii中的蓝色迹线）。
临床尿液样本概述与传统培养方法检测到的病原体分布
在2022年5月至2025年1月期间，从Bnai Zion医疗中心疑似UTI的住院患者中总共收集了154份尿液样本。其中，145份样本使用参考方法和iPRISM测定进行了并行测试。患者年龄范围从17天到101岁。91份（63%）尿液样本来自男性患者，53份（37%）来自女性患者。尿液样本来源多样，物理性质各异。样本处理流程如图1b所示。每个样本被分成两部分，一部分进行标准的临床工作流程，另一部分使用iPRISM分析。这两种分析是同时且独立进行的。
对于iPRISM分析，得出的-ΔI (%)信号既用于感染检测，也用于AST。重要的是，对于使用标准临床程序分析的尿液，临床医生在至少24至48小时孵育后，根据已建立的微生物阈值诊断UTI。在145份由微生物学实验室分析的样本中，96份（66%）被归类为非UTI病例，其中63份为清洁培养，33份为混合微生物生长（图1c）。其余49份样本（34%）显示尿路病原体生长阳性，包括43例单微生物感染和6例多微生物感染（图1c）。图1d总结了已识别的致病病原体，总共分离出56株微生物，包括33株革兰氏阴性菌（59%）、10株革兰氏阳性菌（18%）和13株真菌菌株（23%）。革兰氏阴性菌是最普遍的群体，其中大肠杆菌是最常见的物种（25%）。真菌感染占UTI的比例超过了最常见的革兰氏阳性尿路病原体粪肠球菌。这种趋势与欧洲和中国研究中报告的真菌性UTI患病率上升一致。
iPRISM用于UTI筛查
本研究使用iPRISM通过追踪-ΔI (%)的变化来实时监测微生物生长。如图S2所示，感染样本的三次重复测试通常观察到-ΔI (%)逐渐增加，表明存在菌尿。相比之下，非感染尿液样本通常不显示这种趋势。图2显示了具有代表性的iPRISM图谱，证明了在不同样本中，实时-ΔI (%)响应在斜率和幅度上都表现出变异性。这种变异性反映了微生物载量和细菌生长动力学的差异。尽管如此，iPRISM证明了其在检测多个分类群感染方面的能力。图中展示了大肠杆菌、克雷伯菌属、粪肠球菌和无乳链球菌的代表性示例。高分辨率扫描电子显微镜图像证实，微生物被物理捕获在微图案硅内，并且观察到的光学响应源于它们的物理存在（图2e-h）。
为了评估iPRISM感染筛查性能，最初的分类策略基于-ΔI (%) = 0的固定阈值。在101份临床尿液样本中，iPRISM在90分钟时达到了97%的灵敏度（图3a-iii），从30分钟时的79%提高（图3a-i）。这一趋势与已知的微生物生长动力学一致。相比之下，在同一时期内，特异性仅从57%略微增加到60%（图3a）。这种有限的改进归因于未处理尿液中大量非细菌尿液成分（如白细胞、蛋白质和细胞碎片）引起的光散射。有趣的是，大多数培养阴性的样本（图3a中的绿点）在30分钟后表现出-ΔI (%)的增加可忽略不计，而真正的细菌感染信号则持续分化（图3a）。为了应对这个问题，我们接下来探讨了优化-ΔI (%)阈值是否可以通过考虑基质诱导的信号增加来提高测定的特异性。受试者工作特征分析确定了一个最佳的-ΔI (%)阈值为2.59，对应的曲线下面积为0.87，这表明了强大的快速UTI诊断区分能力。在此阈值下，诊断准确度在75分钟时达到83%，具有均衡的灵敏度（82%）和特异性（81%）（图3d）。时间分析显示，在本研究中，最佳诊断性能出现在75分钟（图3e）。相比之下，在75分钟时应用-ΔI (%) = 0的固定阈值，总体准确度为72%，灵敏度为92%，特异性为60%（图3b）。这些结果表明，阈值优化显著提高了iPRISM测定性能。
虽然本研究的主要焦点是细菌检测，但也进行了一项探索性分析，以评估iPRISM检测真菌感染的能力。将酵母菌阳性尿液纳入ROC分析，在75分钟时产生的AUC较低，为0.79。这种下降可能源于多种因素。尽管如此，iPRISM在80分钟时正确区分了83%的感染样本中的细菌和真菌感染，排除了一例混合感染病例。这一结果表明，即使在未针对真菌检测进行优化的条件下，iPRISM仍保留区分能力，突显了该平台的固有灵活性。
剩余的33例涉及混合菌群的病例，给iPRISM带来了巨大的诊断挑战，这反映了一个公认的临床局限性，可能会使诊断复杂化并延迟针对性治疗。为了以足够的确定性排除UTI并提高iPRISM测定在感染筛查中的特异性，一个有望的方向是在传感平台上应用空间可控的表面化学功能化，同时保持iPRISM平台无捕获探针的特性。
直接对尿液样本进行AST
iPRISM AST与上述UTI筛查在同一临床尿液样本上并行进行，使得能够在同一个iPRISM设备内同时进行感染检测和对庆大霉素和环丙沙星的易感性评估，如图1所示。该测定使用了先前确定的庆大霉素和环丙沙星的MIC折点浓度。然后将结果与使用VITEK 2系统执行的标准AST测试进行比较。
图4a-i和4b-i显示了从培养阳性尿液样本中分离出的大肠杆菌菌株的iPRISM特征结果。图中显示了在存在或不存在抗生素的情况下，对庆大霉素耐药或易感的大肠杆菌菌株的-ΔI (%)值随时间变化。对于耐药菌株（图4a），暴露于庆大霉素90分钟导致的-ΔI (%)值与未处理样本相当。另一方面，易感菌株的相应-ΔI (%)值（图4b）是未处理尿液的30%，表明生长受到抑制。事实上，取回的iPRISM芯片的HR-SEM图像显示，易感菌株的大肠杆菌细胞数量减少（图4b-iii），而耐药菌株则有密集的定殖（图4a-iii），证实了光学响应反映了表型抗生素效应。
–1）的临床人体尿液样本中的性能。(a, b) 从培养阳性尿液样本中分离出大肠杆菌的庆大霉素耐药 (a) 和易感 (b) 代表性病例。(c) 暴露于庆大霉素折点浓度8 μg mL–130分钟后，疑似UTI感染患者尿液样本的iPRISM相对生长值。">
为了以一致的方式定量评估抗生素耐药性，我们计算了相对生长（RG），定义为在给定时间点，暴露于抗生素的样本与未暴露抗生素的样本的-ΔI (%)比值。使用先前验证的大肠杆菌RG阈值0.95，iPRISM在23份临床样本中，在30分钟内与VITEK 2测试对庆大霉素达成了100%的一致性（图4c）。具体来说，91.3%的分离株被准确识别为易感，而8.7%为耐药。在非大肠杆菌尿路病原体中，也观察到了可比的性能。
相比之下，环丙沙星测试在当前测定条件下表现出较低的诊断准确性。在VITEK 2评估的27份尿液样本中，13份耐药（46.5%），15份易感（53.5%）。在90分钟时，iPRISM将5份耐药样本误分类为易感，对应于较高的重大误差率和次优的灵敏度（62%）。此外，还有2个易感分离株也被分类为耐药。ROC分析表明，测定性能随时间推移而改善，在90分钟时达到最大AUC为0.79。然而，基于最大约登指数的阈值优化仅导致特异性略有增加，但降低了整体诊断性能。这些结果表明，环丙沙星AST性能受到使用单一环丙沙星浓度对多种物种进行AST的限制，并且受到临床样本中初始细菌载量变异性的限制，这些都不能完全通过阈值优化来缓解。
iPRISM和VITEK 2结果之间的差异在革兰氏阴性和革兰氏阳性物种中均有观察到。特别是，iPRISM未能完全解析样本#27中的多微生物感染。环丙沙星的作用模式可能进一步使信号解释复杂化。此外，该测定依赖为大肠杆菌建立的单一环丙沙星浓度，似乎简化了iPRISM在不同细菌物种中的适用性。这些观察结果强调，需要为更广泛的病原体量身定制抗生素浓度和MIC计算，以提高诊断精度，特别是在多微生物感染中。
重要的是，该研究强调了一个关键的运营洞察：虽然iPRISM在单一光学平台上集成了同时进行的感染检测和AST，但每个功能在不同的读数时间下运行最佳。感染筛查在延长孵育后（75-90分钟）更有效，而庆大霉素的AST性能在更早的时间点（30分钟内）最佳。
结论
本研究代表了首个直接在尿液上进行、集成感染检测和AST、无需预处理的实时检测双盲临床研究。这种集成直接解决了当前UTI诊断中的一个主要瓶颈，将病原体检测和治疗指导耦合在单个步骤中。这项在贴近患者的床边进行的前瞻性临床研究招募了复杂的住院患者人群，包括预先使用抗生素、多微生物生长和复杂性UTI的病例，为POC集成UTI诊断设立了新的基准。
iPRISM平台在一个简化的测定中实现了快速、不依赖培养的集成UTI筛查和AST。它在90分钟内实现了菌尿筛查97%的灵敏度，在短短30分钟内实现了对庆大霉素易感性分析的100%灵敏度和特异性。这些性能指标表明，可以在与初始治疗决策相关的时间范围内获得具有临床指导意义的结果。
值得注意的是，初步数据表明iPRISM可以区分细菌和真菌感染，这是一个重要但目前尚未满足的诊断需求。此外，目前的验证侧重于住院患者人群，其中包括很大比例的复杂性UTI和多微生物感染。我们预计在门诊护理环境中会有更优的性能，因为在那里非复杂性和大肠杆菌相关的UTI更为普遍。
基于这些优势，未来的发展将针对四个关键领域：通过化学微图案化硅阵列、动态生长分析和自适应机器学习，减轻基质诱导的信号伪影并解决混合菌群干扰；通过自动化的、多路复用平台实现高通量MIC测定并扩展AST能力；合理优化实验条件以扩大对不同细菌和真菌病原体的适用性；以及平台的进一步小型化和集成，以支持真正的POC部署。
通过在首次就诊时，在不干扰现有临床工作流程的情况下，在临床相关的时间框架内提供可操作的即时结果，iPRISM为精准传染病管理和全球抗菌药物管理做出了实用且影响深远的贡献。
