利用遗传密码扩展技术，通过基因编码Nπ-甲基-l-组氨酸改造水解金属酶活性中心，实现催化pKa的有效调控与酸性环境性能提升

《Biochemistry》：Catalytic pKa Attenuation in a Hydrolytic Metalloenzyme by Genetic Code Expansion

本文创新性地运用遗传密码扩展技术，在模型水解金属酶——来自Brevundimonas diminuta的双锌磷酸三酯酶（PTE）——中，将关键的金属配位组氨酸（H55）定点替换为非天然氨基酸（ncAA）Nπ-甲基-l-组氨酸（πMH）。研究表明，这一精准改造不仅成功维持了酶的高效表达与锌/钴离子的配位能力，更系统性地降低了催化pKa，使酶在酸性条件下（pH 4-8.5）的催化活性最高提升达5倍。该工作展示了ncAA工程在金属酶理性设计与性能优化方面的强大潜力，为拓展水解金属酶在复杂生理或环境pH下的应用提供了新策略。

　　

Introduction

水解金属酶利用路易斯酸性金属辅因子激活水分子，产生亲核氢氧根物种以促进催化反应。这类酶的催化效率通常受金属结合水质子化状态的控制，其对应的催化pK_a值通常在6.8至9之间。调控这一参数是扩展酶在中性至酸性pH下活性的关键。

细菌磷酸三酯酶（PTEs）是研究深入的水解金属酶亚群，能够催化有机磷酸酯（如杀虫剂对氧磷）以及沙林、VX等神经毒剂的水解降解，因此在生物修复和去污领域具有潜力。来自Brevundimonas diminuta（原名Pseudomonas diminuta）的PTE（dPTE）拥有一个富含组氨酸的双核金属结合位点。每个金属离子由两个组氨酸残基配位，两个金属离子通过一个羧基化赖氨酸和一个氢氧根离子桥联。H55是α-金属的关键配位组氨酸残基，对催化至关重要。传统的定点诱变研究表明，将H55突变为天冬酰胺会严重损害金属结合和催化效率，并使催化pK_a显著升高，这凸显了研究金属配位组氨酸的挑战。

相比之下，遗传密码扩展技术能够通过引入正交的氨酰-tRNA合成酶（aaRS）/tRNA对，在体内以位点特异性方式掺入非天然氨基酸（ncAAs）。这项技术此前已成功用于改造含铁和铜的蛋白质中的金属配位配体，以精确调控氧化还原电位。因此，本研究提出利用该技术来研究和改造经典的金属水解酶dPTE，旨在提升其在低pH下的水解性能。先前对PTE的ncAA工程主要聚焦于二级配位层，以控制对映选择性和引入静电斥力来加速产物释放。

Methods

本研究选用了一个包含19个稳定化突变（位于活性位点之外）的dPTE工程化变体dPTE2作为平台。利用来自Methanogenic archaeonISO4-G1的工程化G1PylRS^MIFAF/PylT_CUA^G1aaRS/tRNA对，将目标残基H55替换为πMH。蛋白质在补充有ZnCl₂或CoCl₂的培养基中表达，并在诱导前加入πMH。通过链霉亲和素亲和层析纯化蛋白质，并通过液相色谱-质谱联用（LC-MS）、电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）验证蛋白质完整性、ncAA掺入和金属计量比。

酶活测定以一系列对氧磷类似物为底物，通过监测酚盐产物的吸光度变化来进行。在pH 4至8.5的宽范围内测定米氏动力学参数。pH依赖性数据使用三种模型进行拟合：单一电离模型（公式1）、具有两个活性电离态的单电离模型（公式2）以及两个电离物种去质子化均促进催化的模型（公式3）。通过布氏分析探究底物离去基团pK_a（pK_a^LG）对催化参数的影响，并使用最小动力学模型（涉及底物结合（k₁, k₂）、化学水解（k₃）及产物释放/酶再生（k₅）等步骤）对数据进行分析。

通过X射线晶体学解析了锌取代的dPTE2-H55和dPTE2-H55πMH在碱性条件下的高分辨率晶体结构（分辨率分别为1.55 ?和1.69 ?）。

Results and Discussion

The Highly Essential, α-Metal-Coordinating H55 Can Be Efficiently Replaced with πMH

在初步筛选中，多个具有不同共轭酸pK_a的组氨酸类似物ncAA被测试用于替换H55，但只有πMH的掺入能产生显著的酶活性。其他ncAA变体至少导致k_cat下降9倍，尽管金属计量比保持正确，提示活性丧失源于活性位点功能不全而非金属配位丢失。这一结果突显了使用ncAA工程化初级金属配位层的挑战与机遇。

对于dPTE2-H55和dPTE2-H55πMH，在补充锌的情况下蛋白质产量均较高（约80–110 mg/L）。完整蛋白质的LC-MS和胰蛋白酶切产物的LC-MS/MS均证实了πMH的成功掺入。ICP-MS分析证实每个单体含有约两个锌离子。当在培养基中补充钴时，尽管细胞活力和表达水平有所下降，但πMH变体仍能高效掺入并保持每个单体两个钴离子的计量比。这些结果表明，用πMH替换至关重要的α-金属配位组氨酸H55，能够实现较高的蛋白质产量，并能有效配位锌或钴离子。

H55πMH Variants are Highly Active

在略酸性pH 6条件下，针对低pK_a^LG的底物（I, II, III），πMH替换使k_cat提高了1.4至1.9倍，k_cat/K_m提高了1.4至2.4倍。对于锌和钴蛋白，k_cat的变化相似，但k_cat/K_m的改善在含锌活性位点中更为显著。对于高pK_a^LG的“慢”底物IV，在pH 6下所有变体的活性均显著降低；πMH替换仅对锌补充变体的k_cat和k_cat/K_m有轻微改善（1.2和1.4倍），而对钴变体未观察到改善。结论是，πMH替换提高了酸性pH下对低pK_a^LG底物的活性，但改善程度因金属种类和动力学参数而异。

H55πMH Variants Consistently Exhibit Lower Catalytic pK_a

在pH 4至8.5范围内测定米氏动力学。对于底物I-III，在较高pH下πMH替换未引起显著变化；k_cat/K_m在pH 8.5左右达到平台，表明扩散限制动力学。随着pH降低，πMH替换显著提高了k_cat和k_cat/K_m，最高可达5倍。这表明πMH替换在高pH下无害，在低pH下对低pK_a^LG底物有利。相反，对于底物IV，在高pH下πMH替换显著降低了k_cat和k_cat/K_m（最大2倍）；在低pH下，πMH变体的活性与H55变体持平或略高。这揭示了显著的底物依赖性效应和较小的金属依赖性效应。

pH曲线分析表明，k_cat的最佳拟合模型是公式2，显示存在两个通过单一物种电离互变的活性电离态：质子化的ESH+复合物和去质子化的ES复合物。k_cat/K_m的最佳拟合模型是公式1。πMH替换在所有情况下都降低了催化pK_a（pK_a^cat），且来自k_cat/K_m的pK_a^cat变化幅度通常大于来自k_cat的变化。从k_cat模型中提取的k_cat,ESH+和k_cat,ES显示，πMH替换提高了两者的值，且k_cat,ESH+的改善幅度远大于k_cat,ES，表明πMH替换更大程度地改善了质子化途径的催化性能。

在重水（D₂O）中的动力学溶剂同位素效应（KSIE）实验进一步支持了两个催化活性ES态的存在。在高pH下，k_cat的KSIE约为2–2.6，k_cat/K_m的KSIE约为1，与先前报道一致。在扩展的pH范围内，k_cat的KSIE在较低pH下（接近pK_a^cat）显著增加，表明向另一个具有更高KSIE的催化活性ES态转变。πMH替换后，与k_cat相关的KSIE有轻微下降。

Br?nsted Analysis

在pH 7.5–8.5下对底物I-V进行布氏分析。在此pH范围内，ESH+途径对观测速率的贡献小于2%。布氏曲线是非线性的，在低pK_a^LG处存在平台，这与先前将底物区分为“快”（限速步骤在P-O键断裂之后）和“慢”（限速步骤为早期化学步骤）的观察一致。布氏图可通过经典用于PTE的最小动力学模型很好地描述。

通过模型拟合解卷积出各步速率常数（k₁, k₂, k₃, k₅）。三因素方差分析（ANOVA）表明：k₁无显著变化；k₂强烈依赖于金属种类，表明钴ES复合物比锌ES复合物更不易释放底物；k₅依赖于金属种类、pH以及H55/πMH，且存在金属种类与H55/πMH的交互作用。πMH替换以pH依赖的方式提高了k₅的速率，这指向表现pK_a^cat与k₅之间的相关性。推导出的k₅值与底物I-III的k_cat,ES非常相似，表明k₅步骤（涉及酚离去基团释放、磷酸产物释放及活性酶态再生）对ES催化途径是显著限速的。

布氏β值对于锌和钴分别为-1.12 ± 0.17和-1.79 ± 0.17，表明存在一个晚期的、类产物的过渡态，有显著的电荷转移到离去基团酚盐上。πMH替换在pH 7.5–8.5下未引起β值的显著变化，表明在此碱性条件下，πMH替换并未从根本上改变过渡态的性质或限速步骤中的电荷分布。k₅的改善表明，在碱性pH下，对于“快”底物，πMH替换主要影响产物释放或酶再生，而非化学步骤本身。

The Methyl Group Displaces an Ordered Water Molecule

在碱性条件下获得的锌取代的H55和H55πMH变体的高分辨率晶体结构显示，两者单体结构高度相似。最明显的差异是πMH的甲基取代了与H55形成氢键的有序水分子。虽然观察到Zn-Zn、Zn(β)-μO和μO–O_Asp301键长的差异，但考虑到晶胞中的各个单体，这些差异在统计上不显著。Zn(α)–πMH的距离与Zn(α)–H55的距离相当。两种变体的活性位点与已发表的野生型dPTE结构相似。

在碱性pH下活性位点缺乏显著差异，这与观测到H55和πMH在此条件下米氏参数相似一致。在酸性pH下功能出现分歧（πMH显示出更优活性），可能源于pH依赖的配位几何、质子化状态或活性位点动力学的变化，而这些未在静态的高pH结构中被捕获。

Conclusion

本研究将ncAA工程应用于一个经过充分研究的模型金属依赖性PTE（dPTE2）。通过筛选组氨酸类似物ncAAs替换最关键配位组氨酸H55，确定πMH是唯一能在略酸性pH下保持足够活性的候选物。表征表明，H55πMH变体能够高效表达为双锌或双钴酶，并在低pH下表现出高达5倍的活性提升。

尽管受限于对高pK_a^LG底物活性的完全评估以及在低pH下的结构解析，分子层面的详细机制仍有待阐明，但机理分析表明，πMH替换与pK_a^cat的降低、酸性途径催化能力的增强以及P-O键断裂后步骤（k₅）速率的提高相关。结构上，πMH的甲基取代了H55活性位点中的一个有序水分子，可能改变了静电环境或氢键网络。

总之，应用遗传密码扩展技术改造这一关键的金属配位组氨酸，能够更细致地研究该残基的作用，并成功工程化出一个在低pH下催化活性显著提高的酶变体。这些重要进展为ncAA工程作为研究和改善蛋白质功能的有价值工具增添了新的支持，并突显了其在探索多样化金属配位位点方面的机遇。