用于快速且可在现场使用的苹果坏死花叶病毒检测的比色RT-RPA和定量RT-qPCR方法

《Journal of Plant Diseases and Protection》：Colorimetric RT-RPA and quantitative RT-qPCR assays for rapid and field-deployable detection of apple necrotic mosaic virus

苹果坏死斑病毒（ApNMV）检测技术研发。本研究开发RT-RPA快速检测法及RT-qPCR定量技术，RT-RPA检测灵敏度为10^-5（RNA）和10^-4（粗提物），较RT-PCR提高10倍，特异性高且与常规RT-PCR检测率（75% vs 71%）一致，并配套HNB显色系统实现现场判读。RT-qPCR建立标准曲线（R2=0.99，效率98.6%），可定量检测12.9-86.9 copies/样本，为ApNMV防控提供高效工具。

　　

摘要

苹果坏死花叶病毒（ApNMV）（属：Ilarvirus ApNMV）是亚洲地区苹果花叶病的主要致病因子，对苹果种植构成了严重威胁，导致产量大幅下降。鉴于该病毒可通过嫁接传播且目前缺乏抗性品种，因此开发可靠的检测方法对于通过种植材料控制疾病传播至关重要。在本研究中，我们开发了一种快速、灵敏且适用于野外操作的逆转录-重组酶聚合酶扩增（RT-RPA）检测方法来检测ApNMV。我们设计了三组针对RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp）和衣壳蛋白基因的引物对，其中RdRp特异性引物对（282 bp）表现出较高的特异性。使用NaOH:EDTA（1:1）缓冲液制备的粗叶提取物作为模板，无需进行RNA纯化。优化后的检测方法在42°C下孵育35分钟时效果最佳，可检测到低至10^–5稀释度的RNA中的ApNMV，以及在粗提取物模板中低至10^–4稀释度的病毒，其灵敏度比传统RT-PCR高10倍。该方法未与其他常见苹果病毒（ASPV、ASGV、ACLSV、ApMV）发生交叉反应。通过RT-RPA检测，75%的田间样本（73个样本中的55个）呈阳性结果，而RT-PCR的阳性率为71%（73个样本中的52个）。为了便于现场应用，我们将该检测方法与羟基萘酚蓝（HNB）染料结合使用，阳性与阴性反应会产生明显的颜色变化，结果与凝胶电泳结果完全一致。同时，我们还开发了一种基于SYBR Green的RT-qPCR方法用于绝对定量，获得了稳健的标准曲线（R² = 0.99，效率=98.6%），能够检测到田间样本中12.9至86.9拷贝的病毒载量。总体而言，RT-RPA提供了一种快速、简单且适用于野外的诊断工具，而RT-qPCR则实现了精确的定量检测，共同有助于加强对苹果生产系统中ApNMV的监测和管理。