《Journal of Plant Diseases and Protection》：Rapid and highly specific LAMP assay for detection of Meloidogyne exigua
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本文针对咖啡及橡胶树重要病原——根结线虫Meloidogyne exigua缺乏快速分子诊断方法的问题，首次开发了基于28S rDNA的环介导等温扩增（LAMP）检测技术。该技术能在75分钟内特异性检出M. exigua，灵敏度高达2.6 fg μL?1，且不与M. incognita等其他线虫发生交叉反应，为田间快速精准诊断与有效防控提供了高效工具。
在巴西广袤的咖啡园和橡胶林中，一种肉眼难以察觉的微小生物正在悄无声息地威胁着作物的健康与经济产出——它们便是根结线虫（Root-knot nematodes， RKN）。这类定居性内寄生线虫能够侵染包括咖啡在内的多种植物，通过形成根部虫瘿（根结），阻碍水分和养分的吸收，导致作物减产、衰退甚至死亡。其中，由Meloidogyne exigua、M. incognita和M. paranaensis引起的根结线虫病在巴西咖啡产区尤为普遍，而M. exigua更是其中分布最广的物种。尽管其侵袭性不如M. paranaensis和M. incognita，但M. exigua可导致咖啡减产高达45%，并对橡胶树种植构成严重限制，是这些重要经济作物必须面对的关键病原体。
准确识别病原是有效防控的第一步。然而，传统上依赖雌虫会阴花纹的形态学鉴定方法，常常因物种间花纹高度相似而导致误判，例如M. paranaensis就曾长期被误认为M. incognita。基于同工酶（如酯酶）表型的分析方法虽然有所帮助，却又依赖成熟的雌虫样本，应用受限。分子诊断技术，特别是聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction， PCR），为实现精准鉴别带来了曙光。但PCR技术对精密仪器（如热循环仪、电泳系统）的依赖和高昂成本，使其难以在常规诊断实验室，特别是资源有限的田间环境中普及。因此，开发一种快速、准确、经济且设备要求低的诊断方法，成为当务之急。
环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification， LAMP）技术正是在此背景下展现出巨大潜力。作为一种核酸恒温扩增技术，LAMP只需在60-65°C的水浴或加热模块中进行，无需复杂的热循环仪，且反应通常在2小时内完成。更重要的是，通过使用DNA结合染料或pH指示剂，扩增结果可以通过肉眼观察溶液颜色变化（如从红变黄）来判断，无需后续的电泳步骤，极大简化了操作流程，非常适合现场快速检测。此前，科学家们已成功开发出针对多种根结线虫（如M. incognita、M. enterolobii等）的LAMP检测方法，但针对广泛分布于巴西的M. exigua，却始终没有相应的LAMP检测方案。填补这一技术空白，对于及时诊断、防止M. exigua扩散、减少经济损失具有重要的现实意义。于是，一项旨在开发M. exigua特异性LAMP检测技术的研究应运而生，其成果最终发表于《Journal of Plant Diseases and Protection》。
为开展这项研究，研究人员主要运用了几项关键技术：首先，他们从寄主植物（咖啡、大豆、结缕草）上培养并获取了包括M. exigua在内的多种纯化植物寄生线虫种群样本。其次，利用基于28S核糖体DNA（ribosomal DNA， rDNA）D2-D3区序列变异，通过在线软件PrimerExplorer v.5设计了三组LAMP引物。核心实验技术为优化的LAMP反应体系，使用含有pH指示剂的商业化预混液（WarmStart? Colorimetric LAMP 2X Master Mix），在65°C恒温条件下进行75分钟扩增，并通过比色法（颜色变化）和琼脂糖凝胶电泳（观察梯形条带）两种方式判读结果。此外，还通过特异性测试（使用包括M. incognita、M. paranaensis等在内的8种线虫DNA）和灵敏度测试（使用10倍系列稀释的M. exiguaDNA，并与传统PCR进行对比）来系统评估所建立方法的性能。
LAMP反应的优化
研究首先对三组引物进行了筛选和反应条件优化。结果表明，使用引物组2（Primer Set 2）在65°C下反应75分钟，能够成功扩增M. exigua的DNA。阳性结果表现为琼脂糖凝胶电泳中典型的梯形条带模式，以及反应液颜色从红色变为黄色。而阴性对照（不含M. exiguaDNA）则保持红色。由于引物组1和3未能产生稳定或有效的扩增，研究人员最终选择引物组2用于后续所有的特异性与灵敏度测试。
LAMP检测的特异性
为了验证该方法只对目标病原有效，研究人员使用引物组2测试了包括M. exigua、M. incognita、M. javanica、M. paranaensis等在内的多种植物寄生线虫的DNA。结果显示，无论是通过凝胶电泳还是肉眼比色观察，都只在含有M. exiguaDNA的样品中观察到了阳性信号（梯形条带和黄色）。其他所有非目标线虫的DNA样品均未发生扩增，反应液保持红色，证明了该LAMP检测方法对M. exigua具有高度的特异性，可以有效区分在咖啡产区共存的M. incognita和M. paranaensis等重要病原。
LAMP检测的灵敏度
研究人员通过10倍系列稀释M. exigua的DNA来评估该方法的检测下限，并同时使用传统的特异性SCAR标记PCR进行平行对比。结果显示，所开发的LAMP检测技术表现出极高的灵敏度，能够稳定检测到浓度低至2.6 fg μL?1（相当于10?6稀释度）的M. exiguaDNA，通过凝胶电泳和肉眼比色（黄色）均可确认。相比之下，传统的PCR方法最多只能稳定检测到2600 fg μL?1（10?3稀释度）的DNA，在更低浓度下无法检测或仅产生微弱的条带。这证明该LAMP方法的灵敏度至少比所测试的PCR方法高出100倍，这对于检测田间可能存在的低数量线虫种群或DNA质量不佳的样本极具优势。
本研究成功开发了首个用于检测咖啡和橡胶树重要病原——根结线虫Meloidogyne exigua的LAMP方法。该研究基于28S rDNA基因设计特异性引物，建立了一套在75分钟内即可完成、操作简便（仅需恒温设备）、结果判读直观（肉眼比色）的检测体系。其核心结论在于，该方法不仅对M. exigua表现出高度特异性，不与M. incognita、M. paranaensis等在咖啡产区共存的近缘种发生交叉反应，而且还具备极高的检测灵敏度（2.6 fg μL?1），显著优于传统的PCR技术。
在讨论部分，作者强调了这项技术的创新性与实用价值。作为首个针对M. exigua的LAMP检测方案，它填补了该物种快速分子诊断的技术空白。其高特异性确保了在复杂田间环境下的诊断准确性，而其卓越的灵敏度则意味着即使在病原数量极低或样本条件不佳时也能可靠检出，这对于早期预警和病害监测至关重要。此外，该方法的“现场友好”特性（设备要求低、结果肉眼可视）为其未来整合到便携式诊断试剂盒（如结合侧向流动试纸条或智能手机成像）中奠定了基础，有望实现真正的田间即时检测。
该研究的意义不仅在于提供了一种新的诊断工具，更在于为咖啡和橡胶产业的可持续植保管理提供了强有力的技术支撑。通过快速、准确地识别M. exigua，种植者和植保人员能够及时采取针对性的防控措施，如种植抗性品种、实施轮作或精准施用杀线虫剂，从而有效遏制病害蔓延，减少产量损失，保障这两种重要经济作物的生产安全与经济效益。展望未来，研究团队建议进一步优化该技术，尝试直接从感染根系或土壤悬液中简化提取DNA进行检测，以推动该方法在种苗检疫、田间土壤和根系样本监测中的更广泛应用。
