基于截短帽蛋白的间接ELISA方法的开发与应用：用于筛查针对猪圆环病毒3的抗体

《Journal of Virological Methods》：Development and application of truncated cap protein-based indirect ELISA for screening antibodies against porcine circovirus 3

本研究开发了基于重组截短Cap蛋白的间接ELISA方法，用于检测印度猪群中PCV3的血清流行病学调查。该方法经四家实验室验证，具有高特异性（94.5%）和敏感性（97.0%），并首次证实印度猪群中PCV3广泛血清阳性（64.25%），为疾病监测提供有效工具。

　　

D. Dinesh | Sonalika Mahajan | P Madhankumar | Monalisa Sahoo | Karikalan Mathesh | Gaurav Kumar Sharma | Amit Kumar | Triveni Dutt

印度北方邦巴雷利ICAR-印度兽医研究所生物标准化部门

摘要

猪圆环病毒3型（PCV3）是一种新兴病原体，与繁殖失败、呼吸系统疾病、皮炎、肾病和多系统炎症有关，对全球养猪业构成了日益严重的威胁。尽管在印度已有PCV3传播的分子证据，但关于其血清流行率的公开信息尚不存在，因此其暴露程度和群体免疫力仍 largely 未知。血清学工具对于流行病学监测和疫苗效果评估至关重要；然而，经过验证的PCV3检测方法仍然很少。在本研究中，我们开发并评估了一种基于在大肠杆菌中表达的重组截短Cap蛋白的间接酶联免疫吸附测定（ELISA）方法来检测PCV3特异性抗体。使用Cap基因的抗原片段（不包括N端核定位信号）作为包被抗原，并标准化了最佳抗原浓度、血清稀释度和结合条件等检测参数。所开发的ELISA显示出高特异性，与其他常见猪病毒的抗体无交叉反应，相对诊断灵敏度和特异性分别为97.0%和94.5%。该检测方法还具有良好的重复性和再现性，并在四个不同实验室进行了验证，κ值表明结果完全一致。将该检测方法应用于现场血清样本后，发现广泛的血清阳性率（64.25%），这突显了其在PCV3流行病学监测和血清学检测中的实用性。本研究提供了首个可在印度应用的本土ELISA方法，也是首次报告印度PCV3广泛存在的证据。

引言

猪圆环病毒（PCVs）属于Circoviridae科和Cirlivirales目，是一种小型、无包膜的单链DNA病毒（Rosario等人，2017年）。迄今为止，已确认四种类型的PCV，即PCV1、PCV2、PCV3和PCV4。PCV1无致病性，而PCV2被认为是导致猪圆环病毒相关疾病（PCVAD）的病原体，包括断奶后多系统衰竭综合征（PMWS）、呼吸系统疾病和繁殖失败（Allan和Ellis，2000年；Segalés等人，2005年）。2016年，美国在研究猪皮炎和肾病综合征（PDNS）及繁殖失败病例时首次发现了PCV3（Phan等人，2016年；Palinski等人，2017年）。此后，PCV3在全球范围内被广泛发现，越来越多的证据表明它与系统性炎症、先天性震颤以及心脏和肾脏病变等临床表现有关（Klaumann等人，2018a；Jiang等人，2019年）。自首次发现以来，PCV3已在包括中国、韩国、巴西、西班牙、波兰、台湾和日本在内的全球猪群中被检测到，证明了其全球分布（Ku等人，2017年；Kwon等人，2017年；Klaumann等人，2018b；Hayashi等人，2018年；Tochetto等人，2018年；Chang等人，2021年）。有趣的是，PCV3 DNA也在非猪物种中被检测到，包括狗、牛、野猪和蜱虫，这引发了关于其更广泛宿主范围和跨物种传播潜力的问题（Zhang等人，2018年；Franzo等人，2018年；Li等人，2020年；Wang等人，2021年；Sun等人，2025年）。

猪圆环病毒3型（PCV3）的基因组大约包含2000个核苷酸，在结构上与其他圆环病毒相似（Phan等人，2016年；Klaumann等人，2018年）。它编码两个主要开放阅读框（ORFs）：ORF1编码复制相关蛋白（Rep），ORF2编码衣壳（Cap）蛋白。ORF2是唯一具有结构功能的蛋白质，也是所有类型PCV的分子和血清学检测的首选靶标（Kroeger等人，2022年；Li等人，2023年；Chen等人，2025年）。比较基因组分析显示，尽管整体基因组结构保守，PCV3 Cap蛋白与PCV1、PCV2和PCV4的氨基酸同源性分别为24%、26–36%和24.5%（Palinski等人，2017年；Phan等人，2016年）。这种相对较低的序列相似性解释了PCV2和PCV3之间的血清学交叉反应性缺失，因此强调了开发针对PCV3 Cap蛋白的特异性诊断方法的必要性。

全球范围内，已开发出少数基于Cap蛋白的免疫测定方法用于检测PCV-3抗体，并应用于血清学诊断和流行病学研究（Deng等人，2018年；Zhang等人，2019年；Cao等人，2023年；Wang等人，2024b）。然而，据我们所知，目前尚无关于印度PCV3血清流行率的报道，主要是由于缺乏经过验证的血清学检测方法。鉴于印度庞大的养猪业规模持续扩大，开发本土ELISA对于有效监测和流行病学研究至关重要。在本研究中，我们通过基于PCV3 N端截短Cap蛋白（Cap_t）开发并验证了一种间接ELISA方法，并用其评估了现场样本中的PCV3血清阳性率。

部分内容

血清样本

使用了190份猪血清样本（99份阳性，91份阴性），这些样本是通过商业化的ELISA试剂盒AsurDx Porcine Circovirus 3（PCV-3）抗体检测套件（BioStone，美国）确定的，以确定最佳临界值并评估检测方法的诊断灵敏度和特异性。此外，还从不同年龄组和健康状况的猪群中收集了800份随机血清样本，这些猪群来自有组织和无组织的农场。

在大肠杆菌中表达和纯化截短Cap蛋白

成功扩增了PCV3的部分Cap（Cap_t）基因，获得了预期的约564 bp产物（图S1）。将扩增片段克隆到表达载体中，通过菌落PCR（图S2）、限制性内切酶消化（图S3）和核苷酸测序确认了重组菌落。在E. coli BL21(DE3)pLysS细胞中表达重组Cap_t蛋白，发现使用0.5 mM IPTG在30°C下摇床培养5小时可获得最高产量。

讨论

猪圆环病毒3型（PCV3）于2016年在美国首次被发现，当时是在研究猪皮炎和肾病综合征（PDNS）及繁殖失败病例的过程中。作为一种全球关注的新兴病原体，它已在亚洲、欧洲和美洲的猪群中被发现，也在非猪物种中被检测到。多项研究表明，PCV3在临床受影响的猪群中具有抗原性和血清流行率。

资助

本研究由CAAST子项目“高级畜牧业健康中心（CAAST-ACLH）资助，该项目属于世界银行资助的国家农业高等教育项目（NAHEP）。

CRediT作者贡献声明

Triveni Dutt：监督、资金获取、概念构思。 Sonalika Mahajan：写作——审稿与编辑、初稿撰写、监督、方法学、研究、概念构思。 D. Dinesh：写作——初稿撰写、方法学。 Monalisa Sahoo：资源协调、方法学。 P Madhankumar：验证、方法学。 Karikalan Mathesh：写作——审稿与编辑、资源协调。 Amit Kumar：资源协调、资金获取。 Gaurav Kumar Sharma：方法学、概念构思。

利益冲突声明

所有作者均无需要声明的利益冲突。

致谢

作者感谢印度农业研究委员会提供开展这项工作所需的设施。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。