一种用于选择性检测肌酐的竞争性相互作用化学方法

《Microchemical Journal》：A competitive interaction chemistry for selective sensing of creatinine

基于大蒜提取物合成的银纳米颗粒（AgNPs）在碱性条件下通过竞争性相互作用实现肌酐的高选择性检测，抑制Hg2?干扰，检测范围为5-230 μM，限定量5 μM，并成功应用于真实尿液样本。

　　

阿斯米塔·卡尔马卡尔（Asmita Karmakar）| 索姆纳特·巴利（Somnath Bali）| 阿比希克塔·穆克吉（Abhisikta Mukherjee）| 阿维吉特·蒙达尔（Avijit Mondal）

印度加尔各答700073，总统大学（Presidency University）化学系

摘要

在本研究中，通过使用大蒜（Allium sativum）提取物和银离子，采用光诱导的绿色合成方法制备了结晶银纳米颗粒（AgNPs），这些纳米颗粒随后被用作在碱性条件（pH 8.53）下检测肌酐（creatinine）的有效传感探针，同时存在Hg²⁺离子。在暴露于肌酐和Hg²⁺离子之前和之后，使用多种分析技术对AgNPs进行了彻底表征。高分辨率透射电子显微镜（HRTEM）显示，肌酐结合后平均粒径略有增加，但未观察到聚集现象，这证实了纳米颗粒的稳定性。紫外-可见光谱分析显示有两个不同的线性响应区域：最低肌酐浓度为57.69 μM时，可以防止Hg²⁺离子取代AgNPs（250 μM），定量限（LOQ）值为5 μM。这种传感选择性归因于肌酐对AgNPs的包封作用及其与Hg²⁺离子的特异性相互作用（结合常数K_b约为2.29 × 10⁴ M^?1）。循环伏安法和傅里叶变换红外光谱（FTIR）研究支持了Hg²⁺与AgNPs以及Hg²⁺与肌酐之间的相互作用，从而建立了选择性传感的潜在机制。此外，通过实际样品分析成功验证了所开发的方法。

引言

肌酐是肌肉组织中肌酸和磷酸肌酸降解产生的含氮代谢产物，是评估肾功能的重要生物标志物[1]、[2]。它能够被肾脏有效过滤并通过尿液排出，其在生物流体中的浓度是肾脏健康状况的直接指标。慢性肾病（CKD）影响了全球近10%的人口[3]，这突显了早期和准确监测肌酐的重要性，以便及时干预。成年人的尿肌酐浓度通常在男性中为0.7至1.3 mg/dL，在女性中为0.6–1.1 mg/dL[4]，尽管浓度会因年龄、肌肉质量、水分和其他生理因素而有所不同。异常的肌酐水平具有临床意义：升高的值可能表明肾脏清除功能受损、脱水或肌肉分解增加，而较低的值可能反映肌肉质量减少、营养不良、肝脏功能障碍或妊娠相关变化[5]。已经开发了多种分析技术用于检测肌酐，包括比色/光谱测定[6]、[7]、电化学传感器[8]、[9]、[10]、高效液相色谱（HPLC）[12]和质谱[13]。其中，Jaffe方法仍然是最广泛使用的临床检测方法。该方法涉及在碱性条件下苦味酸与肌酐反应，生成一种吸收紫外-可见区域电磁辐射的红橙色复合物[14]。这种方法成本低廉、快速且简单，非常适合常规临床应用。然而，其选择性较差，因为常见的生物干扰物如葡萄糖、抗坏血酸和其他生物分子可能导致肌酐水平被高估[15]。这些不准确性可能会影响肾功能评估的可靠性以及后续的临床决策。为了解决这些问题，基于纳米材料的传感器已成为有前景的替代方案[16]、[17]、[18]。等离子体金和银纳米颗粒（Au/AgNPs）因其可见区域的局域表面等离子体共振（LSPR）而被广泛研究，能够实现高灵敏度的比色检测、快速响应和低成本[16]。这种等离子体系统是一种潜在的纳米生物传感器探针，与其他报道的生物传感器类似[19]、[20]。这些优势使得比色方法成为检测肌酐的有前景的方法，这也是我们研究的基础。Au/AgNPs的聚集/解聚化学过程是肌酐检测的关键因素[17]、[18]。肌酐与AuNPs之间的直接交联反应会导致纳米颗粒从酒红色变为蓝色，这种策略能够检测0.1至20 μM范围内的肌酐浓度，检测限（LOD）为80 μM[18]。Chio等人利用柠檬酸-AuNPs和AuNPs与葫芦脲（cucurbit[7]uril）纳米复合体系统的静电相互作用，通过紫外-可见光谱或表面增强拉曼光谱（SERS）技术分别实现了13 mg/L和12.5 μg/L的肌酐检测限[21]。尿酸/腺苷、Hg²⁺/Ag⁺和肌酐之间的特定配位化学被用于利用AuNPs选择性检测微摩尔水平的肌酐[22]、[23]、[24]。为了评估肌酐的选择性，Das等人使用肌酐结合适配体功能化的AuNPs进行检测，检测限为0.87 μM，并将该策略成功应用于人工尿液样本[25]。类似的肌酐检测技术也应用于AgNPs系统。黄色葡萄糖酸包覆的AgNPs在肌酐作用下聚集变红，该策略能够检测0.3–50 nM范围内的分析物，并应用于人类尿液/血清样本[26]。Parmer等人使用类似Jaffe的方法，通过苦味酸功能化的AgNPs纳米探针提高了检测灵敏度，能够检测低水平的肌酐（0.01–1 μM），并将该传感器成功应用于不同类型的血液和脑脊液（CSF）样本以测定肌酐[27]。肌酐与AgNPs表面配体之间的氢键和静电相互作用在基于聚集的检测中起重要作用[6]。Huang等人报告了Ag⁺离子诱导的银纳米颗粒（AgNPs）聚集导致的明显比色变化，这一关键因素负责肌酐的灵敏检测[28]。虽然有许多关于Ag/AuNPs作为肌酐检测生物传感器探针的报道，但这些探针的主要缺点是复杂的/不可靠的传感策略、探针系统的稳定性、结果的可重复性和实际应用性[17]、[29]。为了解决这些问题，需要开发更稳定和更具选择性的基于纳米颗粒的传感平台。在本研究中，我们报道了一种使用大蒜提取物通过光诱导的绿色合成方法制备的稳定且选择性的AgNP基探针[30]。我们之前的研究表明，这些大蒜提取物包覆的AgNPs在环境光下和广泛的pH范围内具有高度稳定性，适用于生物传感应用[30]。在这里，AgNPs易于合成，具有强烈的表面等离子体共振，其与Hg²⁺离子的反应是众所周知的。这里采用的传感机制基于竞争性相互作用：（i）Hg²⁺离子对AgNPs的置换反应；（ii）在碱性介质中Hg²⁺离子与肌酐之间的特异性配位（图1）。这种传感技术的原理在于通过有效抑制Hg²⁺离子对银纳米颗粒（AgNPs）的干扰，实现肌酐的选择性定量。这种双重相互作用策略能够在5–230 μM的浓度范围内选择性地检测肌酐，这一点通过紫外-可见光谱得到了证实。该检测方法具有高灵敏度，定量限（LOQ）值为5 μM，并由于肌酐在AgNPs周围的包封作用及其对Hg²⁺离子的优先结合而表现出强选择性。该检测方法显示，在肌酐存在下，AgNPs的颜色受到保护，不会变成无色或浑浊，显示出良好的灵敏度和选择性，这得益于纳米效应以及AgNPs在碱性介质（特别是pH 8.53）中的良好吸收和消光系数。据我们所知，这是首次使用绿色AgNPs探索这种传感策略，且几乎未观察到来自肌酐类似分子和共存离子的干扰。支持信息（表S1）提供了一个总结各种文献中使用的AgNPs和其他纳米颗粒检测肌酐的方法的比较表。重要的是，该方法已成功应用于实际的人类尿液样本，证实了其在实际生物医学应用中的潜力。

化学试剂

新鲜的大蒜购自印度加尔各答的一家杂货店。AgNO₃从Sigma-Aldrich公司购买。所有实验均使用双蒸水。本研究中使用的不同材料（肌酐（≥ 99%）、天冬氨酸、葡萄糖、半胱氨酸、尿素、胆红素、尿酸、组氨酸、MgSO₄、NiCl₂、CdCl₂、NaCl、FeCl₃、PbNO₃、KCl）均从SRL化学品有限公司（SRL chemicals Pvt. Ltd.）购买。肌酐的储备溶液制备浓度为5 mM，而其他所有储备溶液

传感器探针的合成与表征

在环境阳光下合成了含有大蒜提取物的稳定AgNPs，其中含硫化合物作为稳定剂，酚类化合物与阳光共同作为还原剂[31]、[32]、[33]、[34]、[35]。银离子在阳光下有自然还原的趋势，而在天然配体的存在下，这种光还原过程显著增强，从而形成稳定的胶体银纳米颗粒。Allium sativum（大蒜）提取物和阳光

结论

总之，我们开发了一种低成本的、光诱导的绿色合成方法，用于在Hg²⁺离子存在下选择性检测肌酐。在碱性介质中，肌酐抑制了Hg²⁺离子与AgNPs之间的置换反应，确保了这种传感器探针在汞离子和肌酐存在的水介质中保持稳定。肌酐检测分为两个阶段：SPR信号在50 μM以下呈线性下降，随后在更高浓度下呈线性上升

作者贡献

AK和SB的贡献相同。

CRediT作者贡献声明

阿斯米塔·卡尔马卡尔（Asmita Karmakar）：撰写——原始草稿、方法学、实验研究。索姆纳特·巴利（Somnath Bali）：撰写——审稿与编辑、可视化、形式分析、数据管理。阿比希克塔·穆克吉（Abhisikta Mukherjee）：可视化、形式分析。阿维吉特·蒙达尔（Avijit Mondal）：撰写——审稿与编辑、可视化、监督、资金获取、数据管理、概念构思。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。

致谢

AM感谢总统大学提供的财务支持和研究设施，同时也感谢印度科学促进协会提供的研究设施。