《mSphere》：High-resolution imaging techniques to interrogate virus-host interactions
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这篇综述系统性地介绍了当前正在革新病毒学研究的多种高分辨率成像技术，包括扩展显微镜（ExM）、结构光照明显微镜（SIM）、受激发射损耗显微镜（STED）、直接随机光学重建显微镜（dSTORM）、聚焦离子束扫描电子显微镜（FIB-SEM）、冷冻电子显微镜（cryo-EM）、冷冻电子断层扫描技术（cryo-ET）以及关联光学和电子显微镜（CLEM）。文章重点讨论了这些技术在解析病毒生命周期各阶段（如进入、复制、组装和释放）中与宿主细胞动态、复杂相互作用的独特优势和具体应用实例，展现了成像技术如何揭示先前未知的病毒-宿主界面机制，并推动了对病毒感染机理和潜在治疗靶点的理解。
摘要
病毒是严格依赖宿主细胞机制完成其生命周期的专性寄生物。因此，探究病毒与宿主相互作用的本质不仅能增进我们对这些微生物致病机制的理解，也有助于加深对基本细胞生物学过程的认识。本综述重点介绍了当前正在革新病毒学研究的高分辨率成像技术，并讨论了如何利用它们来提升我们识别和探究新型病毒-宿主相互作用的能力。
引言
数十年来，显微镜一直是病毒学研究的重要工具。其多种应用已被用于剖析病毒感染几乎每一步背后的基本原理，包括受体结合、内化、运输、复制、组装和释放。虽然生化和分子生物学技术无疑增进了我们对病毒-宿主相互作用的理解，但能够可视化被感染细胞内发生的事件，对于阐明病毒生命周期的关键方面和产生驱动研究前进的新假说而言是无价的。此外，观察病毒感染期间发生的独特细胞变化也可能揭示细胞生物学的新原理。本综述将重点介绍目前可用于病毒学研究的一些先进成像技术，简要概述每种技术，并讨论它们在以高分辨率研究病毒-宿主相互作用时的优势和局限性（表1）。
扩展显微镜
扩展显微镜（ExM）涉及对固定生物样本进行物理放大，以便使用传统显微镜对这些样本进行高分辨率成像。该技术利用可膨胀的聚电解质水凝胶，将细胞和组织各向同性地扩大数倍，同时仍保留准确的生物信息。典型的ExM方案需要对以下步骤进行优化：标记、凝胶化、消化、扩张和成像。ExM最近已成为研究病毒感染期间发生的时空相互作用的重要工具。鉴于研究病毒-宿主相互作用时的分辨率障碍，该技术允许更清晰地可视化那些用传统免疫荧光方案可能不易检测的病毒蛋白。
研究人员已利用ExM来解答关于人类免疫缺陷病毒（HIV）感染的重要问题。例如，Petrich等人使用ExM在宿主细胞核中识别了病毒复制中心。他们发现，不同的HIV-1衣壳种群可以在宿主细胞核内被区分可视化，这些信号与不同的细胞成分共定位，表明ExM可用于区分HIV-1复制的不同阶段。另一项研究利用ExM阐明了HIV-1在质膜上的组装和释放过程，显示一种先前鉴定的磷脂酰肌醇4,5-二磷酸在宿主细胞表面靠近Gag蛋白处积累，并在募集和整合调节病毒传播的细胞跨膜蛋白（如CD43、PSGL-1和CD44）到病毒包膜中起直接作用。总的来说，ExM的独特之处在于它允许研究人员使用更常见的显微镜获得“超分辨率”图像，使其成为全球病毒学研究人员更负担得起且更易使用的工具。
结构光照明显微镜
结构光照明显微镜（SIM）已成为生物科学中广泛使用的成像工具。该技术使用一系列结构化的正弦图案来照射未知的生物样本，仅需要宽场荧光显微镜，特别适用于获取活细胞的超分辨率图像。样品以叠加图案形式的结构化激发光照射，这些接近光学衍射极限的周期性干涉图案产生高分辨率成像数据，随后可以使用现有算法进行重建。SIM可用于收集二维和三维图像，具体取决于用于创建照明图案的激光束数量。
SIM已被用于研究多瘤病毒在宿主细胞核内的复制。通过使用三维SIM更详细地检查鼠多瘤病毒（MuPyV）的病毒复制中心，研究人员发现MuPyV在其病毒复制中心内诱导了空间上不同的亚结构域，这些区域分别由病毒大T抗原或细胞RPA32蛋白的明亮信号标记。脉冲追踪标记显示，病毒DNA信号最初在病毒复制中心内与大T抗原相关，但在病毒DNA合成后的第一个小时内重新定位到RPA32灶。此外，病毒复制中心相关的RPA32是过度磷酸化的，表明它可能与协助下游病毒DNA处理的DNA损伤反应信号传导有关。
受激发射损耗显微镜
受激发射损耗（STED）显微镜是一种超分辨率荧光显微镜技术，可提供比传统共聚焦显微镜更高的分辨率。其原理是利用一个环形损耗激光器，创建一个更小、更清晰的视场。在此激发中心之外的荧光团保持在不发荧光的暗态。使用这两个激光束允许研究人员通过选择环形视场内被激发的区域来缩小成像体积。与SIM类似，STED显微镜可以生成二维和三维图像，并且与活细胞成像兼容，且不需要进一步的计算处理。
Baharom等人利用STED显微镜提供的改进分辨率，可视化了甲型流感病毒的早期运输事件。他们使用三色STED显微镜策略，可视化了IAV核蛋白与早期内体标记物EEA1以及晚期内体/溶酶体标记物LAMP1的共定位，并追踪了病毒从早期到晚期内体区室直至到达细胞核的过程。另一项研究使用STED显微镜研究了沙粒病毒传播的复杂机制。他们发现淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒可以通过隧道纳米管连接绕过传统的细胞外感染途径进行传播，STED显微镜使他们能够直接可视化LCMV的病毒GP-1结构成分位于连接邻近细胞的含F-肌动蛋白的隧道纳米管丝内。
直接随机光学重建显微镜
直接随机光学重建显微镜（dSTORM）是另一种超分辨率显微镜技术，它使用传统的有机荧光团，以约20纳米的XY分辨率成像单个分子。在还原剂存在下使用光开关荧光团，允许其随时间的推移被随机激活和检测。该信号最初记录为图像堆栈，然后可以从大量单分子坐标重建出人工图像，从而提供目标对象的超分辨率图像。
dSTORM已显示出在可视化病毒结构方面的潜力，例如病毒衣壳蛋白的排列以及与宿主细胞机制在感染早期的相互作用。例如，Brice等人使用dSTORM可视化了病毒感染期间单个微管丝的结构变化。他们发现，当比较致病性和非致病性狂犬病病毒时，非致病性病毒表现出微管结合和IFN/STAT1拮抗作用受损。通过dSTORM，他们能够可视化微管结构的特异性改变，这些改变是致病性狂犬病病毒感染所特有的。
聚焦离子束扫描电子显微镜
聚焦离子束（FIB）技术与扫描电子显微镜（SEM）结合成单一技术，使研究人员能够以<10纳米的分辨率检查表层下的细胞结构。这种三维成像技术有时被称为“体积电子显微镜”，可以提供大面积组织体积的详细结构信息。FIB涉及以3-10纳米的间隔用镓离子反复照射样品，然后用SEM成像以捕获感兴趣生物结构的连续图像。这会产生许多图像，可以对齐并处理成样本的三维渲染。
研究人员已使用FIB-SEM来可视化病毒感染背景下细胞结构的重排。例如，Bagchi等人使用FIB-SEM研究了猿猴病毒40感染诱导的内质网膜焦点结构的分子结构。他们发现该焦点由多管状内质网连接组成花状结构，SV40位于该结构的中心。另一项研究使用FIB-SEM研究了HIV-1在病毒组装和释放过程中对细胞肌动蛋白的重排，发现HIV-1定位在丝状伪足和片状伪足的尖端和脊部，表明HIV-1劫持了与膜曲率相关的途径，以促进通过细胞接触位点的病毒传播。
冷冻电子显微镜
冷冻电子显微镜（cryo-EM）通过允许研究人员在保持结构完整性的同时获得纯化样品的近原子分辨率图像，彻底改变了结构生物学领域。这些进步得益于能够将有机物质快速闪冻或玻璃化在薄层玻璃态冰中的新方法，从而保存样品的天然状态。
该技术最常用的变体之一是单颗粒冷冻电镜，其中将大量相同蛋白质或复合物在不同方向上的二维投影数据组合起来，以创建精确的三维结构表示。迄今为止，通过单颗粒冷冻电镜解析的最高分辨率结构中有一些是二十面体病毒，例如腺相关病毒，这是由于它们的高度对称性和相对较大的分子量。该方法已用于解析许多影响人类健康的病毒结构，包括导致2020年全球大流行的SARS-CoV-2。通过使用单颗粒冷冻电镜解析病毒刺突蛋白的结构，研究人员获得了疫苗和治疗开发的宝贵见解。
冷冻电子断层扫描技术
冷冻电子断层扫描技术（cryo-ET）是一种最先进的方法，通过收集相对于显微镜电子束不同角度拍摄的一系列图像来准确捕获细胞内结构。这些图像使用计算流程组合，生成样本的详细三维断层图。平均方法可用于进一步细化数据，并提供关于感兴趣结构的更详细信息。鉴于其能够在未染色的细胞中捕获细胞成分，原位冷冻电子断层扫描已成为可视化细胞内异质或“独一无二”结构的强大工具。
研究人员现在使用cryo-ET来扩展冷冻电镜在研究病毒和病毒样颗粒结构以及受感染细胞内病毒-宿主相互作用方面的应用范围。例如，Prasad等人使用cryo-ET可视化了基孔肯雅病毒膜融合的中间步骤，包括细胞膜粘附和病毒基因组释放。另一项研究使用cryo-ET解决了IAV在受感染宿主细胞核内复制后如何组装的谜题。他们发现单个病毒核糖核蛋白复合体在包含Rab11a的内膜上被分选和聚集，以促进下游的病毒组装。
关联光学和电子显微镜
关联光学和电子显微镜（CLEM）将荧光显微镜和电子显微镜的各自优势结合到一种技术中。具体来说，它允许在细胞的整体复杂组织中观察各种蛋白质、RNA和病毒的多色标记。其执行方式有两种：1）使用单独的光学显微镜和电子显微镜对同一样本成像的结果进行关联；2）在同时完成两项任务的集成系统上进行成像。这种方法通过允许研究人员在细胞内精确定位感兴趣区域并获得该特定区域的高分辨率结构信息，彻底改变了生物医学研究，包括病毒学。
与其他技术一样，CLEM可用于推进对感染生命周期各个阶段（包括复制）中病毒-宿主相互作用的研究。例如，Romero-Brey等人使用带有GFP标签的丙型肝炎病毒复制子，使他们能够特异性观察GFP阳性的细胞结构以识别HCV阳性细胞。他们观察到这些细胞含有围绕脂滴积累的双膜囊泡，这些囊泡靠近内质网。Zila等人的工作则结合了CLEM和cryo-ET，帮助解决了HIV如何进入细胞核进行基因组整合的谜题。他们表明完整的HIV衣壳可以穿透核孔复合体的中央通道，并且核孔复合体支架会扩张到约64纳米的直径，足以容纳这种病毒货物。后续研究使用集成cryo-ET和CLEM的冷冻FIB铣削技术，更精确地可视化了HIV衣壳在核输入不同阶段的情况，识别并表征了包括接近、停靠、穿越和最终导入在内的四个不同阶段。
结论
在这篇综述中，我们重点介绍了当前正在革新生物医学研究的高分辨率成像技术，并提供了研究人员如何利用这些方法来识别和表征新型病毒-宿主相互作用的实例。随着成像方法的不断进步，病毒学领域也将不断前进，因为我们不断发展的、可视化受感染细胞内发生事件的能力，一直是并将继续是发展对这些微小微生物及其与宿主相互作用新理解的关键。展望未来，我们预计更多的病毒学家将开始合作使用这些技术来解答他们的研究问题。通过将先进的成像方法与其他分子生物学和生化技术相结合，我们可以继续推进对病毒感染潜在机制的理解，并更多地了解它们所感染细胞的生物学特性，最终扩展疫苗和治疗发现以改善人类健康。
