豚鼠（Cavia porcellus）是一种原产于秘鲁、厄瓜多尔、哥伦比亚和玻利维亚安第斯地区的啮齿类哺乳动物。在这些国家，豚鼠具有文化、营养和经济价值，其生产对安第斯农村社区的食物安全和家庭收入做出了贡献[15]。在厄瓜多尔，豚鼠养殖主要还是传统的家庭经营方式，尤其是在安第斯高地[2]，尽管生产已扩展到沿海和亚马逊地区。豚鼠肉因其高营养价值（蛋白质含量19.3–20.3%，多不饱和脂肪酸6–20%[38]）而在当地饮食和烹饪旅游中广受喜爱。近年来，人均年消费量约为3.3公斤/人，其中女性占养猪户的80%以上[9,35]。然而，最近的遗传学研究表明，厄瓜多尔和其他安第斯国家的本土豚鼠资源正在持续减少，这突显了实施保护和恢复策略的迫切需要[4]。在这种情况下，生殖生物技术可以帮助保护这些宝贵的动物遗传资源[28]。
精子冷冻和人工授精（AI）被广泛用于保存和管理家养和野生哺乳动物的遗传物质。然而，在豚鼠中，这些技术的应用一直受到限制，主要是因为解冻后的精子存活率很低或不存在[19,48]。尽管最近的研究表明可以通过电刺激等方法成功回收豚鼠精液[6]，但关于其冷冻保存和解冻后质量评估的可靠研究仍然不足。相反，从睾丸切除后的雄性或死后豚鼠中获取的附睾精子通过各种方法（切片或逆行冲洗）已成为冷冻保存的宝贵资源[19,37,46]。
迄今为止，只有两项研究评估了豚鼠精子的冷冻保存情况，两者都报告了传统慢速（CS）冷冻后的低存活率[11,19]。在这些研究中，精子样本通过将其置于静态液氮（LN2）蒸汽中5–10分钟进行传统冷冻，这种方法的冷却速率最初约为39°C/分钟，协议结束时降至15°C/分钟[19]。这种CS冷冻条件可能导致细胞在冰核形成期间（播种）无法充分脱水，特别是在-5°C至-25°C的关键温度范围内[13,20,27]，从而促进致命的细胞内冰形成。因此，与CS冷冻相关的主要冰冻损伤包括DNA改变和线粒体膜功能破坏，最终影响精子活力和运动学参数[3,10]。
相对较大的豚鼠精子头部及其较大的顶体被认为会阻碍冷冻和解冻过程，其他野生物种（如欧洲水貂和考拉）也有类似报道[32]。这种物种特有的形态可能限制了CS冷冻过程中的最佳脱水效果，特别是在播种阶段（初始冷却速率较高时），可能增加细胞内冰形成的风险。鉴于豚鼠精子解冻后的存活率非常低（<15%），我们评估了超快速（UR）冷冻作为一种可能更合适的替代方法。这一结论与跨物种证据一致，表明某些物种（如瞪羚、长颈鹿和棕熊）的附睾精子在UR冷冻后的抗冰冻能力更强，尽管仅凭精子头部面积并不能准确预测其冷冻存活率[32]。
UR冷冻是一种依赖于极高冷却速率（>2000°C/分钟）和相对较高浓度的非穿透性冷冻保护剂（CPAs）的替代方法。蔗糖和海藻糖（100–250 mM）等二糖常用于UR冷冻，并通常添加到基于卵黄的培养基（如TCG-EY（Tris、柠檬酸、葡萄糖和6–20%卵黄）中[16]。重要的是，扩展剂的组成在冷却/平衡过程中就会影响精子功能；因此，CPA的选择可能会在冷冻前就改变精子的运动能力、活力和顶体完整性。渗透性甘油（CS协议的典型成分）可能会造成浓度和添加相关的渗透压/化学应力，而非穿透性二糖（如蔗糖，常用于UR方法）主要通过调节脱水和膜稳定性提供渗透保护[47]。UR冷冻已应用于多种家养物种（如牛、犬、猫等）[17,18,43]以及野生动物[7,8,39]，解冻后的运动能力和活力结果各不相同。在人类精子中，UR冷冻已被提出作为CS冷冻的替代方法，可改善精液质量并减少DNA损伤[36]。此外，在荒野鹿、盘羊、瞪羚、长颈鹿和熊的附睾精子中，使用100 mM蔗糖进行UR冷冻后的运动能力和活力与CS冷冻相当或更高（约40%[32]）。总体而言，证据支持UR冷冻是豚鼠精子冷冻保存的有效技术。
因此，本研究通过评估冷冻前（稀释/平衡后）和冷冻后的豚鼠附睾精子的运动学参数、精子膜和DNA完整性以及形态学头部尺寸，比较了传统慢速（基于甘油的）和超快速（基于蔗糖的）冷冻方法，因为扩展剂的组成可能会影响这两个阶段的精子质量。
