《Journal of the American Society for Mass Spectrometry》：Profiling of Low-Abundance Branched-Chain Fatty Acids via Radical Directed Dissociation Tandem Mass Spectrometry
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本期推荐的论文发展了一种新型衍生化试剂MeO-QN，并结合反相液相色谱-质谱(RPLC-MS)，实现了对痕量支链脂肪酸(BCFAs)的甲基分支位点进行精准定位。该方法灵敏度高，检测限达亚纳摩尔级，并成功应用于人类血浆和乳腺癌细胞的脂肪酸分析，为相关代谢和疾病研究提供了强有力的分析工具。
引言
脂肪酸(FA)是构成多种复杂脂质分子的基本单元，在细胞能量代谢和信号转导中扮演关键角色。支链脂肪酸(BCFA)是脂肪酸的一个亚类，其特征是脂肪酰基链上连接有一个或多个甲基支链。BCFA主要源自肠道细菌、乳汁和乳制品，其潜在的健康促进特性日益引起研究关注。然而，在哺乳动物组织中，BCFA的浓度相对较低，占脂肪酸总量的比例不到1%（皮肤和胎脂除外），因此迫切需要开发灵敏的分析方法对其进行鉴定和定量。
传统的脂肪酸分析方法是将其衍生化为脂肪酸甲酯(FAME)后，利用气相色谱-电子轰击质谱(GC-EI-MS)进行分析。但该方法难以区分同分异构的BCFA，因为缺乏指示甲基分支的特征离子，且这些异构体在GC中经常共洗脱。Ran-Ressler等人将串联质谱(MS/MS)与EI-MS联用，实现了对饱和BCFA甲酯的可靠鉴定。EI-MS/MS与共价加合物化学电离质谱(CACI-MS)的结合，进一步完成了对单不饱和BCFA的完整结构解析。Wang等人最近开发了一种基于化学电离(CI)的“三离子监测”方法，与之前的方法相比，对BCFA的分析灵敏度有所提高。
随着电喷雾电离(ESI)的发展，脂肪酸越来越多地通过ESI-MS/MS结合碰撞诱导解离(CID)进行分析。然而，在负离子模式下分析时，脱羧和脱水是主要的碎裂途径，因此对链修饰信息的获取有限。另一种方法是，在衍生化引入固定正电荷后（例如使用N-(4-氨基甲基苯基)吡啶鎓(AMPP)或通过气相离子/离子电荷反转），使用较高能量CID（>50 eV）可引发电荷远程碎裂(CRF)。CRF诱导沿脂肪酰基链的断裂，可用于定位甲基分支的anteiso构型，但无法区分iso-异构体和直链异构体。另一方面，自由基定向碎裂(RDD)能够在脂肪酰基链上产生丰富的链内断裂，从而有助于更有效地鉴定链修饰。RDD可通过含不稳定发色团（如碳-碘(C–I)键）的脂质离子的紫外光解离(UVPD)引发。Blanksby课题组开发了一种固定电荷光解试剂I-AMPP+，并成功将该衍生化方法与266 nm UVPD整合到液相色谱(LC)-MS工作流程中。McLuckey课题组利用[Mg(Terpyridine-TEMPO)2]2+和[Mg(tributyl-terpyridine)2]2+作为试剂离子，将气相中的去质子化脂肪酸偶电子阴离子转化为自由基阳离子，并证明通过CID产生的自由基阳离子可以定位甲基分支位点。本课题组先前开发了CID触发的RDD方法用于脂质结构分析。脂肪酸经O-苄基羟胺(O-BHA)衍生化后，其锂离子加合物的CID会形成脂质氮氧自由基，产生指示甲基分支的碎片。然而，该方法需要添加锂离子来增强RDD，这在与反相液相色谱(RPLC)联用时存在局限性。
实验结果与讨论
1. CID触发喹啉-O·自由基RDD
本研究发现了一种新的RDD试剂——1-(8-甲氧基-5-喹啉基)甲胺(MeO-QN)，它既能实现电荷转换，又能通过CID触发RDD来定位BCFA的甲基分支。尽管中性MeO-QN分子中C-O键的解离能(BDE)高达63.7 kcal/mol，但[MeO-QN+H]+的MS2CID谱图显示，通过丢失甲基自由基(•CH3)，可以较高丰度地产生QN-O•自由基离子(m/z 174.080)。密度泛函理论(DFT)计算表明，质子化后，MeO-QN的O原子与喹啉氮上的质子之间形成了2.19 ?的分子内氢键，产生了一个稳定的五元环，导致O–CH3的BDE降至48.5 kcal/mol。谱图中还观察到由CH4丢失产生的m/z 173.073碎片峰，以及连续丢失•CH3和•NH2产生的m/z 158.061碎片峰（图中标记为“Q”）。此外，m/z 146.061的碎片则是连续丢失•CH3和CO导致环闭合形成的。
+的MS2CID谱图。(c) FA与MeO-QN的衍生化反应及CID下衍生化FA([FA#+ H]+)的推测碎裂途径。">
为了探究QN-O•是否能诱导脂肪酰基链内的碳-碳键断裂（下文称为链内断裂），研究者使用全氘代脂肪酸FA 17:0-D33作为模型化合物。衍生化效率经测定为100%。对比MeO-QN衍生化FA ([FA 17:0-D33#+ H]+)在束型CID和离子阱CID条件下的MS/MS行为，发现尽管未检测到FA QN-O•自由基阳离子(m/z 459)，但在两种CID条件下均观察到一系列始于甲基末端、间隔16 Da（CD2）的碎片峰（m/z 441, 425, ..., 233）。这些碎片应来源于RDD过程，即QN-O•沿酰基链夺取一个D原子，引发自由基传播和随后的链内断裂。此外，还观察到另一系列丰度低得多的、同样间隔16 Da（CD2）的碎片离子（如m/z 390, 374, ..., 246），这些离子应来源于CRF，其产生位点距甲基末端5-6个碳原子，且丰度随其接近羰基末端而增加。由于RDD过程需要额外丢失一个非氘代的甲基，因此FA 17:0-D33在同一断裂位点通过CRF产生的碎片比通过RDD产生的碎片重14 Da。研究发现，束型CID中CRF更占优势，而离子阱CID中几乎不存在CRF。因此，后续对BCFA的分析选择了离子阱CID模式。
2. 通过QN-O• RDD定位甲基分支
使用FA n-17:0及其两个支链异构体FA i-17:0和FA a-17:0来探究QN-O•诱导的RDD是否能区分BCFA。比较这些MeO-QN衍生化异构体的离子阱CID谱图发现，对于FA n-17:0，形成了一系列间隔14 Da的碎片（从m/z 411到m/z 215），源自顺序丢失15 Da (-•CH3)和•CnH2n+1。然而，连续的离子系列被一个明显的28 Da (C2H4)间隔打断，这是由于分支位点相邻的C–C键断裂所致，例如i-17:0的m/z 383和411离子对，以及a-17:0的m/z 369和397离子对。这个28 Da的间隔是识别和定位甲基分支的特征标记。有趣的是，离子对中较低m/z的碎片比较高m/z的碎片表现出更高的离子丰度，这可能是因为更稳定的仲碳中心自由基（即异丙基自由基）比伯碳中心自由基更容易丢失。
#+H]+, (b) [i-17:0#+H]+, (c) [a-17:0#+H]+, 以及 (d) [FA 16:0;3Me,7Me,11Me,15Me#+H]+。">
除了两种BCFA特有的28 Da间隔模式外，三种异构体还共享其他一些常见碎片（m/z 150到m/z 230）。m/z 229的碎片离子可能由C3–C4键断裂形成，产生一个共轭烯酮离子。m/z 216是一个自由基阳离子，由C2–C3键断裂产生。而[MeO-QN+H]+(m/z 189)则由酰胺键断裂形成。m/z 158的碎片（标记为“Q”片段）是所有三种异构体的基础碎片峰，后续被用于MS/MS定量。研究者也对三种脂肪酸衍生物进行了束型CID分析，但RDD碎片的生成丰度要低得多。除了单甲基-BCFA，研究者还使用类异戊二烯脂肪酸植烷酸(FA 16:0;3Me,7Me,11Me,15Me)作为多甲基-BCFA的模型。CID诱导的RDD分别对n-2、n-6、n-10和n-14位的甲基分支提供了特征的28 Da峰间隔。这些发现表明，QN-O• RDD适用于定位单甲基和多甲基BCFA中的甲基分支。
3. 分析其他类型的链修饰
研究还测试了QN-O• RDD是否能定位其他类型的链修饰，如C=C双键、环丙烷和羟基修饰。然而，研究发现难以区分C=C双键和环丙醇。从喹啉到C=C双键和环丙烷基团的质子迁移所需能量分别约为35和47 kcal/mol，均低于质子化MeO-QN中C–O键的BDE，因此抑制了这两种链修饰周围的RDD碎裂。对于羟基脂肪酸，在正离子模式下，水的丢失占主导地位，检测到的RDD极少。
4. 用于生物样本BCFA分析的RPLC-MS/MS工作流程
QN-O• RDD MS/MS方法进一步被整合到RPLC-MS/MS工作流程中。简言之，脂肪酸异构体通过RPLC分离；在随后的MS/MS实验中，RDD碎片用于鉴定，而对Q碎片(m/z 158)的前体离子扫描(PIS)则用于脂肪酸的相对定量。值得注意的是，喹啉的气相碱度为220.2 kcal/mol，甚至高于吡啶（214.6 kcal/mol）。因此，MeO-QN衍生化脂肪酸在正离子模式ESI下的离子信号得到增强，显著提高了检测灵敏度。
工作流程总结如下：首先，将游离脂肪酸(FFA)或经皂化获得的总脂肪酸(TFA)使用MeO-QN进行衍生化。进行两次独立进样以实现脂肪酸的定量和鉴定。经RPLC分离后，在正离子模式下对m/z 158进行PIS，以获得脂肪酸组成的分析谱图。随后，利用QN-O• RDD确定每个色谱峰的支链位置。对于未完全分离的色谱峰，使用PeakFit 4.12软件进行反卷积，反卷积过程使用残差法，峰类型设为高斯型。
该方法的线性动态范围约为4个数量级（5 nM至25 μM）。对于直链和单甲基支链脂肪酸，鉴定限(LOI)低至0.2 nM，对于植烷酸为1 nM，显著优于先前报道的氮氧自由基RDD方法。
5. 人血浆中FFA的分析
循环FFA为生理活动提供燃料并参与重要的信号事件。越来越多的证据表明BCFA与炎症相关，并在调节能量代谢中发挥重要作用。研究者将QN-O• RDD工作流程应用于分析混合人血浆中的FFA。研究发现，即使使用LC-MS级别的溶剂，也难以避免脂肪酸的溶剂污染。因此，研究者为每个样品分析设置了空白提取物进行背景校正。只有当AFA/AIS超过背景水平(AFA/AIS)空白的三倍时，才确认生物样品中存在该脂肪酸。
研究者共鉴定出52种精确到分支位点的FFA，包括17种饱和直链FA、13种饱和BCFA和22种不饱和FA。这些FA亚组的浓度跨度达4个数量级，所有饱和BCFA的浓度均在亚微摩尔水平。与Menzel等人最近报道的FFA相比，本研究揭示了极长链脂肪酸(VLCFA)的存在，例如n-25:0、n-26:0和FA i-24:0。更重要的是，在FA 17:0的另外三个主要异构体中，研究者鉴定出了FA 16:0;12Me，即n-5甲基支链异构体。
#+H]+(m/z 441)的XIC。(c) 图b中21.0分钟洗脱峰的离子阱CID谱图。">
在人血浆中FA 17:0的XIC图上，可以看到四个主要洗脱峰。以21.0分钟洗脱峰为例，其RDD数据显示，m/z 341和m/z 369离子对之间特征性的28 Da间隔表明存在n-5甲基分支。该n-5异构体占FA 17:0总量的2%，在RPLC上的洗脱时间早于iso-（21.5分钟）、anteiso-（21.2分钟）和直链（22.2分钟）异构体。数据还显示，奇数碳FA以直链、iso-和anteiso-异构体形式存在，而偶数碳FA仅以直链和iso-形式存在。据推测，人体内的BCFA主要来源于膳食，尤其是乳制品、反刍动物乳汁和其他反刍动物源性食品。
6. 人乳腺癌细胞与正常细胞中TFA的分析
最近研究发现，BCFA（如i-15:0）具有抗癌特性。研究者以人乳腺癌细胞系MDA-MB-468和正常乳腺上皮细胞系MCF-10A为模型，探究了癌细胞与正常细胞之间在支链水平上的总脂肪酸组成差异。当归一化到总脂肪酸含量时，不饱和脂肪酸表现出显著变化。在癌细胞中，大多数单不饱和脂肪酸(FA 18:1)和多不饱和脂肪酸（饱和度高于3的FA 20:4、FA 22:5、FA 22:6）的水平显著增加，这可能是由于脂质从头合成中脱饱和酶活性增强所致。相比之下，FA 18:2和FA 20:2的水平显著降低，而FA 14:2和FA 26:2在癌细胞中无法检测到。
在5组饱和BCFA中，癌细胞中FA i-16:0和FA i-18:0的相对组成分别为0.7%和0.3%，与正常细胞中的1.8%和0.9%相比显著降低。Toda等人曾报道，FA i-16:0对脂肪酸合成具有抑制作用，从而导致乳腺癌细胞死亡。癌细胞中偶数链BCFA水平降低的机制尚不清楚，但这可能为人类健康评估和疾病相关分析提供新的见解。
结论
总之，本研究开发了一种利用MeO-QN作为电荷转换试剂和自由基前体，进行CID触发RDD MS/MS分析BCFA的新方法。该方法显著提高了从复杂脂质组中分析BCFA的灵敏度和可靠性，即使是在亚纳摩尔浓度下也能实现。研究证实了混合人血浆中存在不常见的n-5甲基支链脂肪酸(FA 16:0;12Me)。此外，与正常乳腺细胞相比，乳腺癌细胞中FA i-16:0和FA i-18:0的减少，可能为乳腺癌代谢重塑研究提供新的视角。
