《Acta Diabetologica》：A high-quality RNA-yielding protocol for laser capture microdissection of transplanted stem cell-derived Islets of Langerhans
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本研究聚焦于移植干细胞来源胰岛（SC-islets）研究的瓶颈问题——缺乏经RNA质量评估的激光捕获显微切割（LCM）方案。研究人员开发了一种优化的LCM流程，在胰腺、肝脏、肾被膜、网膜和肌肉等多个器官移植位点成功获得了高质量的RNA，为研究不同移植微环境下SC-islets的转录组特征提供了有力工具。
胰岛移植是治疗1型糖尿病的潜在方法，而由人类干细胞分化而来的干细胞来源胰岛（Stem Cell-derived Islets, SC-islets）为这一领域提供了无限的细胞来源。为了优化移植方案并理解SC-islets在不同移植部位的存活和功能差异，科学家们需要深入分析移植后胰岛的基因表达谱。激光捕获显微切割（Laser Capture Microdissection, LCM）技术允许研究者从复杂的组织中精确分离出特定的细胞群，结合RNA测序（RNA-Sequencing）技术，可以解析特定细胞群落的转录组信息。然而，获取高质量RNA是进行可靠转录组分析的前提。对于移植的SC-islets，特别是在肝脏、网膜等手术难以完整取回的移植位点，如何通过LCM获取高质量的RNA用于下游分析，仍是一个技术挑战。目前，文献中缺乏专门针对移植SC-islets、并评估其RNA质量的LCM标准化方案。本研究旨在填补这一空白，开发并验证一种能从多个移植位点的SC-islets中稳定获得高质量RNA的LCM方案，从而推进移植胰岛的分子机制研究。
为了回答上述问题，研究人员主要运用了以下几项关键技术方法：首先，使用免疫缺陷的NOG小鼠作为受体，将SC-islets移植到五个不同的器官部位（胰腺、肝脏、肾被膜、网膜、肌肉）。其次，核心技术是基于Leica LMD6000 B显微镜的激光捕获显微切割，配合一套优化的样本前处理流程，包括快速冷冻组织、使用75%乙醇固定、采用酒精性染料Cresyl violet进行染色以避免水基溶液损伤RNA、以及严格的脱水步骤。第三，使用Qiagen RNeasy Micro Plus试剂盒进行RNA提取。最后，利用Agilent 5400 Fragment Analyzer进行RNA质量评估，以RNA完整性指数（RNA Integrity Number, RIN）作为主要衡量标准。
Results
研究结果显示，所有移植位点均能获得可测序的RNA。其中，胰腺移植位点获得的RNA质量最为稳健，平均RIN值最高（平均8.2），尽管胰腺本身因高RNase含量而通常被认为对RNA提取具有挑战性。相反，肝脏和网膜等移植体积较小或分布分散的位点，其平均RIN值较低（分别为5.9和4.4）。数据分析揭示了一个关键趋势：RIN值与显微切割获取的组织面积呈正相关。这意味着，从大块、密集的移植物中获取RNA更容易获得高质量结果，而从小而分散的移植物中获取RNA则更具挑战性，这很可能是因为后者需要更长的LCM操作时间，导致RNA在室温下降解的风险增加。下图直观展示了不同移植位点的RIN值分布情况。此外，研究还通过下图进一步确认了RIN值与切割面积之间的正相关关系，其斜率为0.23，R平方值为0.3。
讨论与结论
本研究成功开发并验证了一种适用于移植干细胞来源胰岛（SC-islets）的激光捕获显微切割（LCM）方案，能够从胰腺、肝脏、肾被膜、网膜和肌肉等多个移植位点获得高质量的RNA。尽管所有位点都有单个样本获得了高RIN值（>9），但总体而言，小型化或分散化的移植物（如肝脏和网膜）确实给获得高质量RNA带来了更大挑战，这主要归因于更耗时的显微切割过程导致了RNA更长时间地暴露于室温环境。一个有趣的发现是，尽管胰腺富含RNase，但本研究方案在胰腺位点取得了最稳定的高质量RNA结果，这可能得益于胰腺移植物通常较大且聚集，便于快速切割和收集。研究还讨论了在LCM方案中使用RNase抑制剂的价值，认为在采用了本方案（即避免水基染色、充分脱水）的前提下，RNase抑制剂可能并非必需，但对于免疫荧光标记等需用水基溶液的免疫LCM（immuno-LCM）则是有益的。
总之，这项研究的意义在于，它提供了一套标准化、可重复的LCM操作流程，首次系统地评估了从多种移植位点的SC-islets中获取RNA的质量。该方案使得研究者能够对传统手术难以取回的移植胰岛（如肝脏内胰岛）进行转录组学分析，从而为深入比较不同移植微环境对胰岛存活、功能及免疫反应的影响提供了关键技术支持。这项发表在《Acta Diabetologica》上的工作，为干细胞来源胰岛移植的基础与转化研究奠定了重要的方法学基础。
