海洋生物中汞的物种特异性同位素分析：提取和氧化方法的系统评估，以实现简便的分析方法

《Talanta》：Species-specific isotopic analysis of mercury in marine biota: systematic evaluation of extraction and oxidation methods for a straightforward analytical approach

汞同位素分析及其环境应用研究。评估了甲基汞（MeHg）的液液萃取与微波氧化法，采用NaBr/H2SO4/CuSO4混合体系实现高效提取，通过硝酸氧化转化为Hg2?后结合冷蒸气-多采集电感耦合等离子体质谱（CVG-MC-ICP-MS）完成同位素分析。验证了该方法在三个标准参考材料及四种海洋生物样本中的可靠性，为汞环境行为研究提供新工具。

　　

马蒂亚斯·范德梅伦（Mathias Vandermeiren）| 莱娜·阿布-扎伊德（Lana Abou-Zeid）| 西蒙娜·布雷尔（Simone Braeuer）| 弗兰克·范哈克（Frank Vanhaecke）

原子与质谱研究组（Atomic & Mass Spectrometry Research Unit），根特大学（Ghent University）化学系，Sterre校区 – S12号楼，De Pintelaan 270号，9000根特，比利时

摘要

汞（Hg）是一种全球分布的重金属，对环境和健康具有重大影响。在其生物地球化学循环中，汞可以转化为多种化学形态，包括甲基汞（MeHg），这是一种强效的神经毒素，能够穿越生物屏障，从而对人类神经系统构成严重威胁，尤其是对胎儿和婴儿。虽然测定汞浓度及其形态分析已经提供了宝贵的信息，但同位素分析，特别是针对特定物种的同位素分析，可以揭示汞各形态在环境中的迁移路径和转化过程的详细信息。然而，现有的针对特定物种的同位素分析技术方法，如气相色谱与多收集器电感耦合等离子体质谱（MC-ICP-MS）的在线结合，或先分离汞物种再进行MC-ICP-MS分析的离线方法，仍存在一些挑战和缺点。本研究评估了多种从海洋生物基质中选择性提取甲基汞的方法，并将其氧化为Hg²⁺，从而实现使用冷蒸气发生（CVG）与MC-ICP-MS结合的离线同位素分析。评估并优化了三种不同的提取方法。其中一种方法使用NaBr、H₂SO₄和CuSO₄的混合物进行提取，随后用Na₂S₂O₃溶液将甲基汞反萃取回水相，该方法被证明是最有效的，能够从基质中定量回收甲基汞。随后发现，使用浓HNO₃和H₂O₂在微波辅助下进行氧化是最可靠和高效的方法，可将甲基汞定量氧化为Hg²⁺。优化后的工作流程应用于三种经过认证的参考物质（ERM-CE 464、BCR-414和TORT-3），其结果与先前报道的数据一致，并通过四种新鲜海洋样品验证了该方法的有效性，突显了其在涉及汞的环境和毒理学研究中的广泛应用潜力。

引言

汞（Hg）是一种天然存在于地壳中的有毒重金属。由于人类活动，其在环境中的浓度显著增加，对人类和野生动物构成了严重威胁。(1),(2) 汞在环境中以无机形式（Hg⁰和Hg²⁺）和有机形式（主要是甲基汞MeHg）存在，它们在毒性、迁移性和生物可利用性方面存在显著差异。(3) 例如，Hg⁰由于其挥发性而具有高度迁移性，可以在大气中长距离传播后沉积到环境中，但其生物可利用性较低。相比之下，Hg²⁺非常活泼，在水生环境中可被微生物甲基化转化为MeHg。(4) 后者具有高生物可利用性，容易通过海洋食物链积累和放大。因此，鱼类和海鲜的消费是人类接触甲基汞的主要来源。世界卫生组织（WHO）将甲基汞确定为重要的公共卫生问题，因为它能够穿越血脑屏障（BBB）并在大脑中积累，导致严重的神经毒性效应。(5)

鉴于甲基汞的毒性和威胁，了解和揭示其环境迁移路径是一个备受关注的研究课题。(6),(7),(8),(9) 这些路径的复杂性，涉及多种甲基化和去甲基化过程，仅通过批量定量和形态分析难以准确追踪其在环境中的主要来源。汞有七种稳定同位素，原子质量范围从196到204 amu。由于同位素之间的质量差异，在物理化学过程中反应速率和/或化学平衡会略有不同，导致质量依赖性分馏（MDF）。也可能会发生质量独立性分馏（MIF），主要影响奇数质量的汞同位素，据报道这是由于磁同位素效应或核体积效应等现象造成的。(10),(11) 因此，揭示和量化样品间汞同位素组成的差异是揭示汞所经历的不同化学转化过程及其在环境中的迁移路径的有效方法。(12),(13),(14),(15),(16)

汞的同位素分析通常在样品完全酸消化后进行，因此关注的是所谓总汞（THg）的同位素组成，包括其所有化学形态（批量同位素分析）。(8),(9),(17) 这种方法没有充分利用所有可用信息，因为各个汞物种的独特同位素特征可能会丢失，进一步增加了数据解释的难度。为了解决这一限制，可以对每个单独的物种进行同位素分析，从而充分发挥同位素分析的潜力。(17),(18) 以往已经提出了在高精度同位素分析之前分离不同汞物种的方法，通常采用在线或离线设置。第一种方法通常是将气相色谱（GC）与多收集器电感耦合等离子体质谱（MC-ICP-MS）在线结合，(19),(20) 较少使用高效液相色谱（HPLC）后进行在线或离线的MC-ICP-MS测量以确定各物种的同位素组成。(21) Epov等人（2008年）的初步研究表明，GC和MC-ICP-MS的在线结合可用于甲基汞和无机汞（Hg²⁺的物种特异性同位素分析。(20),(22) 然而，也报告了一些缺点，主要问题是衍生化步骤中可能发生人为的汞同位素分馏，而衍生化步骤是在GC分离之前必要的，以便将所有汞物种（实际上是离子形式MeHg⁺或盐形式MeHgCl）转化为挥发性形式。(23) 此外，GC分离出的化合物信号具有短暂的性质（几秒钟内），可能导致同位素比值测量的准确性和精度下降。这是由于用于监测不同同位素离子束强度的MC-ICP-MS法拉第杯响应相对较慢且不同步造成的，需要仔细校正以防止同位素比值测量偏差。(24),(25) 与GC相比，HPLC的优势在于不需要衍生化步骤，并产生持续时间更长的信号，从而提高同位素比值的精度。然而，其主要局限性在于某些HPLC流动相与MC-ICP-MS的兼容性有限，因为某些溶剂或添加剂由于碳含量高可能不适合直接引入等离子体。(26)

另外，还开发了将甲基汞从Hg²⁺中分离出来进行后续定量或特定物种汞同位素分析的方法。这些方法通常结合了基于酸或盐的提取步骤(27),(28) 和/或纯化步骤，如溶剂分配、硫化物共沉淀(29)、吹扫-捕集装置或带有分数收集的色谱法(30)。这些协议已成功应用于多种样品类型，如土壤、(27)、海洋生物、(27)、大米、(33)、血液和头发(34)，但主要是用于汞物种的定量，很少用于特定物种汞同位素组成的评估。(32),(35) 与在线色谱方法相比，这些方法具有显著优势，主要与使用冷蒸气发生（CVG）作为MC-ICP-MS引入系统的更简单离线操作有关。实际上，CVG-MC-ICP-MS已成为高精度汞同位素分析的标准方法，因为它在干等离子体条件下引入Hg(0)，由于Hg²⁺与SnCl₂的选择性反应，从而显著提高了灵敏度。(36),(37) 此外，它产生的连续信号提高了同位素比值测量的精度，优于具有短暂信号的在线色谱方法。(28),(30) 尽管如此，大多数已发表的离线方法并未被其他研究人员进一步采用，因为它们要么依赖于许多实验室通常不具备的复杂仪器，要么包含耗时较长的步骤，不适合例如涉及大量样品的环境研究。

另一种更简单的方法依赖于选择性液-液提取，其优势在于所需的仪器设置较为简单，样品通量较高。(28) 虽然这种提取方法能够高效且相对快速地分离各种汞物种，但在CVG-MC-ICP-MS之前需要额外的氧化步骤。这一步确保了甲基汞完全转化为Hg²⁺，这对于CVG是必要的，因为SnCl₂仅选择性地还原Hg²⁺。为此目的使用了多种氧化剂，包括高锰酸盐（KMnO₄）(38)、重铬酸盐（K₂Cr₂O₇）(39)、过硫酸盐（K₂S₂O₈）(40)和溴化物/溴酸盐（KBr/KBrO₃）(41)。

在这项研究中，我们系统评估了文献中报道的各种提取和氧化方法，旨在实现一种简单、快速且可靠的离线特定物种汞同位素分析方法，使用CVG-MC-ICP-MS对海洋生物组织进行分析。通过HPLC-ICP-MS对提取和氧化方法的效率进行了评估。使用三种含有不同比例甲基汞的海洋来源的认证参考物质（ERM-CE 464、BCR-414和TORT-3）验证了优化方法的有效性。这些物质之前已通过不同的提取和纯化方案进行了批量和特定物种汞同位素组成的研究。最后，该方法应用于四种含有不同甲基汞含量的海洋生物样品，包括来自Brosme Brosme的肌肉和肝脏组织以及来自Cancer pagurus的爪肉和肝胰腺。

材料与化学品

超纯水（>18.2 MΩ cm）来自Milli-Q Element（Millipore，法国）的水净化系统。超纯级硝酸和盐酸从Sigma-Aldrich（美国）购买，或者通过Fisher Chemicals（英国）提供的Pro-analysis 14 M HNO₃和12 M HCl在PFA Savillex DST净化系统（Savillex，美国）中亚沸蒸馏获得。其他使用的化学品列在电子补充信息（ESI 表S1）中。无金属聚丙烯...

甲基汞的选择性提取

使用CE-464参考物质和鱼肝及肌肉组织样品测试了总提取方法和三种选择性提取方法（图1）。用不同方法获得的甲基汞部分进行了两种不同的分析：(i) 使用HPLC-ICP-MS进行形态分析，以量化提取的甲基汞含量以及提取物中是否存在残留的Hg²⁺；(ii) 使用ICP-MS/MS进行THg定量，以验证HPLC-ICP-MS的结果。

结论

在这项工作中，我们系统比较了从海洋样品/参考物质中选择性提取甲基汞的不同方法及其后续氧化方法，从而使用CVG-MC-ICP-MS实现了Hg²⁺和甲基汞的特定物种同位素分析。在评估的提取方法中，使用NaBr、H₂SO₄、CuSO₄和甲苯的方法（方法B，改编自Masbou等人）(28) 在定量提取样品中的甲基汞方面最为有效。

CRediT作者贡献声明

弗兰克·范哈克（Frank Vanhaecke）：撰写 – 审稿与编辑、监督、项目管理、资金获取、概念构思。马蒂亚斯·范德梅伦（Mathias Vandermeiren）：撰写 – 初稿撰写、可视化、验证、方法学研究、数据分析、数据管理。莱娜·阿布-扎伊德（Lana Abou-Zeid）：撰写 – 审稿与编辑、监督。西蒙娜·布雷尔（Simone Braeuer）：撰写 – 审稿与编辑、验证、方法学研究、数据分析、数据管理、概念构思

利益冲突声明

? 作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。

致谢

作者衷心感谢挪威卑尔根的海洋研究所（IMR）提供Brosme Brosme和Cancer pangurus样品的采集和处理。

弗兰克·范哈克感谢FWO-Vlaanderen提供MC-ICP-MS仪器（ZW15-02 – G0H6216 N）的资助。