《Talanta》：Efficient purification of extracellular vesicles via circular multicavity electrophoresis coupled with ultrafiltration
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外泌体纯化与肝癌治疗新方法：环形多腔电泳联合超滤高效制备脐带间充质干细胞来源外泌体，显著提升纯度与产量，通过激活p38 MAPK信号通路增强HepG2细胞凋亡效果，为临床应用提供高效平台。
杨新蕾|邢宇航|邢少良|金静|李东浩|任向山|刘璐
中国吉林省延吉市公园路977号延边大学化学系，邮编133002
摘要
细胞外囊泡（EVs）作为细胞间通讯的关键介质，已成为疾病诊断和治疗的有希望的生物标志物，因此获得高纯度、高产量的EVs至关重要。然而，传统的制备方法如超速离心（UC）和磁激活细胞分选（MACS）等在去除复杂样本中的共存蛋白质方面存在困难，并且受到产量低和成本高的限制，这限制了其在大规模临床应用中的使用。因此，开发一种高纯度EVs的制备方法对于最大化EVs的生物功能以及替代靶向小分子药物用于临床应用具有益处。本研究采用循环多腔电泳（CME）和超滤（UF）结合的方法，成功分离出了高纯度的脐带间充质干细胞衍生的细胞外囊泡（UCMSC-EVs）。与传统超速离心方法相比，该方法显著提高了EVs的纯度和产量，减少了蛋白质污染，并增强了UCMSC-EVs的抗肿瘤效果。评估表明，CME纯化的UCMSC-EVs保持了结构完整性和生物活性。高纯度的UCMSC-EVs在诱导HepG2细胞凋亡方面表现出比索拉非尼（SFB）疗法更高的安全性和有效性。从机制上讲，这些纯化的EVs激活了肝癌细胞中的p38 MAPK信号通路，促进了细胞凋亡。该方法建立了一个稳健、通用的平台，可用于从多种生物来源制备高纯度的细胞外囊泡（EVs），实现了快速、高通量的分离和高效纯化，确保了污染物的有效去除。这些能力为推进EVs的基础研究及其临床转化提供了巨大潜力，显著促进了诊断应用和治疗方法的发展。
引言
肝细胞癌（HCC）是最常见的肝癌类型，也是导致癌症相关死亡的主要原因之一[1]。HCC的传统治疗方法包括肝切除术[2]、移植[3]、放疗[4]和化疗[5]，以及靶向治疗和免疫治疗[6]等。然而，药物耐受性[7]和肝损伤[8]等副作用严重影响了治疗效果[8]。随着间充质干细胞研究的不断进步，为HCC的治疗提供了新的见解。间充质干细胞（MSC）可以从多种人体组织和器官中获取，如骨髓、脐带、脂肪组织、大脑和胰腺等[9,10]。它们可以调节多种与癌症相关的生物过程，包括转移、血管生成和上皮-间充质转化[11]。脐带间充质干细胞（UCMSC）具有出色的肝脏修复能力，可以通过分泌细胞因子、抑制肝细胞增殖和修复肝脏损伤来辅助肝癌的治疗[12,13]。与靶向药物治疗和其他治疗方法相比，干细胞衍生的细胞外囊泡具有类似的临床益处，同时避免了活细胞移植的生物安全问题[14,15]。阻碍干细胞衍生细胞外囊泡临床应用的主要挑战是由于缺乏高效工具而导致的细胞外囊泡的大规模生产和纯化[16,17]。
超速离心（UC）是外泌体制备的金标准，但在去除复杂样本中的共存蛋白质方面存在困难[18,19]。此外，大样本量和高耗时等问题仍未得到解决[20]，这限制了UCMSC EVs的进一步临床应用[21]。磁激活细胞分选（MACS）提供了一种相对高纯度的EVs分离方法，但MACS也存在产量低和成本高的局限性。其他EVs制备方法也面临通量有限、EVs破坏以及大规模生产困难的问题。如我们之前的研究所示，循环非均匀电场凝胶电泳提供了一种分离和浓缩按电荷-大小分布的纳米颗粒的新方法[22]。因此，我们建立了一种基于梯度凝胶和电场的循环多腔电泳方法，用于高纯度和高产量的细胞外囊泡（EVs）生产[23]。在本研究中，我们将循环多腔电泳与超滤（CME-UF）相结合，同时提高了EVs的纯度和产量，为后续研究HepG2细胞中的凋亡诱导提供了有效的方法。该方法利用EVs的电荷-大小比例作为主要分离原理。CME-UF过程无需标记，并在连续流动条件下进行，实现了高产量的分离同时保持了EVs的生物活性。我们比较了CME-UF分离的EVs与UC和MACS分离的EVs在纯度、细胞摄取效率以及对HepG2细胞存活率的影响。此外，我们还研究了高纯度EVs对HCC细胞的生物学效应，并阐明了其作用机制。
材料与试剂
本研究使用的材料包括琼脂糖（Biowest，法国）、5×TBE电泳缓冲液（Sangon Biotech，中国）、铂丝（电极材料，天津卢城金属，中国）和3D打印聚乳酸（PLA）丝材（BASF，德国）。试剂包括Dil（LMAI Bio，中国）、CCK-8和比色蛋白测定试剂盒（BCA，Yeasen Biotechnology，中国）、蛋白质提取试剂盒（Solarbio，中国）以及10%聚丙烯酰胺凝胶电泳缓冲液
利用CME-UF制备UCMSC EVs
考虑到UCMSC EVs的电荷-大小比例，CME结合了琼脂糖凝胶中的梯度圆形电场和孔径梯度分布（图1A–B）。梯度圆形非均匀电场的分布是通过COMSOL软件模拟的。水平方向上，电场强度随半径减小而逐渐增加；在垂直方向上，顶部、中部和底部的电场强度相等（图1A）。
结论
总之，我们证明了CME-UF是一种有效的制备高纯度UCMSC EVs的方法。与传统UC和MACS方法相比，CME-UF获得了更高的UCMSC EVs产量和纯度。这些高纯度的EVs对HepG2细胞增殖表现出强烈的抑制作用，为SFB靶向药物治疗提供了一种替代方案。这种方法在从多种来源制备EVs方面具有巨大潜力，有望推动疾病诊断和治疗应用的发展。
作者贡献声明
杨新蕾：撰写初稿、方法学设计、概念构思。
邢宇航：撰写初稿、方法学设计、数据管理。
邢少良：方法学设计、数据管理。
金静：方法学设计、数据管理。
李东浩：撰写、审稿与编辑、项目监督、资金筹集、概念构思。
任向山：撰写、审稿与编辑、项目监督。
刘璐：撰写、审稿与编辑、项目监督、资金筹集。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文研究的财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（项目编号：22304150、22376177、81660609）和延边大学的研究与创新团队的支持。
