基于微芯片电泳技术的生物膜表面邻近性诱导分支杂交链反应策略，用于区分来自不同癌细胞的外泌体

《Talanta》：Biofilm surface proximity-induced branched hybridization chain reaction strategy based on microchip electrophoresis for distinguishing exosomes from different cancer cells

Exosome检测灵敏度提升方法研究基于微芯片电泳辅助的bHCR信号放大策略，通过EpCAM蛋白特异性识别区分乳腺癌细胞（MCF-7）与其他癌症（A549、HeLa）来源的exosome，检测限达250 exosomes/μL。

　　

陈宇海|薛瑞杰|张胜义|叶梦颖|赵京金

中国广西师范大学生态脆弱地区环境过程与修复重点实验室，桂林，541004

摘要

外泌体表面含有多种癌症标志物，这些标志物可作为早期癌症诊断和治疗效果评估的理想候选物。然而，由于外泌体体积非常小，检测其表面的肿瘤标志物仍面临重大挑战。为了解决这些问题，本文提出了一种基于微芯片电泳辅助的生物膜表面邻近诱导分支杂交链反应（bHCR）的信号放大策略，以区分不同类型的外泌体。该策略利用适配体通过生物膜表面的邻近杂交反应识别外泌体表面的上皮细胞粘附分子（EpCAM）蛋白。多级bHCR设计用于信号放大，使得在MCF-7细胞中可检测到低至250个外泌体/μL的浓度。当用于区分不同类型癌细胞产生的外泌体时，结果显示MCF-7细胞产生的外泌体膜表面含有大量EpCAM蛋白分子，而A549和HeLa细胞产生的外泌体中EpCAM蛋白分子相对较少。这一发现表明EpCAM蛋白在乳腺癌细胞分泌的外泌体表面高度表达，并且不同类型癌细胞中外EpCAM蛋白的表达也存在差异。所开发的方法在外泌体分析方面具有重要的应用潜力，有望为乳腺癌筛查和预后评估提供新的技术平台。

引言

外泌体是一种由细胞主动分泌的磷脂双层囊泡，直径通常在30-150纳米之间[1,2]。由于其特定组成取决于母细胞，因此它们携带了来自母细胞的信息，并且与单个细胞一样具有异质性。尽管外泌体的生物活性尚未完全阐明[3]，但多项研究表明，外泌体通过调节肿瘤微环境参与肿瘤迁移和侵袭，并携带有关肿瘤微环境的信息[4]。外泌体表面含有多种疾病生物标志物[5]，如上皮细胞粘附分子（EpCAM）、程序性死亡配体1（PD-L1）、表皮生长因子受体（EGFR）、甲胎蛋白（AFP）、黏蛋白1（MUC1）、血小板衍生生长因子（PDGF）、前列腺特异性抗原（PSA）和CD109分子等[5]。检测外泌体表面的疾病标志物蛋白分子有助于早期诊断癌症[6]、代谢性疾病和神经系统疾病[7,8]。其中，EpCAM作为一种跨膜糖蛋白，主要在上皮组织和大多数上皮源性恶性肿瘤中表达，被视为癌症干细胞的标志物，可用于癌症的诊断、治疗和预后评估。因此，外泌体是早期癌症检测的优秀无创潜在指标。

在癌症早期阶段，生物液体中外泌体的数量较少，这使得准确测量变得困难。因此，提高现有检测方法的灵敏度是外泌体分析领域亟需解决的问题。然而，大多数传统的生物样本分析方法（如流式细胞术[9]、酶联免疫吸附测定[10]和免疫印迹[11]）需要复杂的样本预处理和耗时的操作，并且对外泌体分析的灵敏度和特异性有限。为了克服这些限制，研究人员开发了多种方法来提高灵敏度和特异性，如表面等离子体共振[12]、电化学分析[13]和荧光分析[14]。其中，荧光测定因其高灵敏度和简单操作而受到关注。尽管传统荧光分析仍存在样本需求量大和背景信号高的缺点，但微芯片电泳与荧光检测的结合在样本量有限的情况下具有显著优势。这种方法将背景信号分离和目标信号检测过程集成在几厘米大小的芯片上，大大消除了背景信号的干扰，提高了检测的准确性，因此在样本量有限的生物分析领域具有广泛的应用。

杂交链反应（HCR）是一种用于DNA链替代反应的等温信号放大技术。它是一种非酶促的自主核酸放大方法，通过触发发夹寡核苷酸的打开形成长链DNA来实现。HCR因其操作简单、设计灵活、放大效率高以及易于与核酸单元集成而被用于检测生物膜表面蛋白[15,16]。大多数HCR系统使用适配体识别表面蛋白，然后引入两个发夹结构，这些结构向外延伸并组装成双链DNA[5,17,18]。在严格的原位杂交条件下，标准HCR的灵敏度较低，因为发夹聚合的驱动能量减少[19]。然而，分支杂交链反应（bHCR）在更严格的杂交条件下可以提高灵敏度[20]。

在本研究中，提出了一种基于微芯片电泳的生物膜表面邻近诱导bHCR信号放大方法，用于区分不同癌细胞产生的外泌体。首先，合理设计了两个识别探针（P1、P2）和四个DNA发夹（H1、H2、H3、H4）。P1的3′端标记有胆固醇，以便插入外泌体膜表面的磷脂双层中，而P2的5′端是EpCAM适配体SYL3C[21]。发夹H2的3′端和H4的5′端标记有荧光染料羧基荧光素（FAM）。这种方法将bHCR的起始链分为两部分，一部分位于胆固醇标记的探针P1的5′端，另一部分位于适配体探针P2的3′端，以避免未与EpCAM蛋白结合的游离起始链产生的假阳性结果。在外泌体存在的情况下，探针P2识别EpCAM蛋白并选择性地结合到外泌体膜表面，通过与探针P1的互补碱基配对进行折叠。这样，两个启动子片段靠近在一起形成完整的触发链，最终触发bHCR的自组装。随后，发夹探针H1和H2可以交替打开，形成分支杂交链反应的骨架部分。发夹H3和H4的独特设计包括H1环区和H2趾区（红色部分）中的两个分裂启动子片段。当骨架组装完成时，这两个分裂的启动子片段之间的距离缩小，激活了次级HCR循环，使得发夹探针H3和H4在探针H1和H2之间进行分支生长。当探针H1、H2、H3和H4与外泌体共孵育时，这些发夹通过在外泌体膜表面的EpCAM蛋白上形成超分支组装而具有高荧光。通过基于微芯片电泳平台分析组装的外泌体，可以检测到两个不同位置的峰值，从而实现对外泌体的检测（图1）。

材料与仪器

人乳腺癌细胞系MCF-7、人肺癌肺泡基底上皮细胞系A549、人宫颈癌细胞系HeLa和人结直肠癌细胞系HCT116购自中国科学院典型培养物委员会/细胞资源中心上海生命科学研究院的细胞库（上海，中国）。DNA标记物、5×Tris-borate-EDTA（TBE）缓冲液、6×DNA加载缓冲液及各种DNA探针均购自上海

外泌体的表征

通过高速超离心法从MCF-7细胞培养基的上清液中分离出外泌体（Exo_MCF-7）。然后，通过透射电子显微镜（TEM）成像、纳米粒子追踪分析（NTA）和Western blot（WB）蛋白分析对外泌体进行表征。TEM成像结果显示，来自MCF-7细胞的外泌体呈球形形态（图1a）[22]。三次平行实验的NTA表征结果符合

结论

本研究提出了一种基于芯片电泳辅助的生物膜表面邻近诱导bHCR的新颖可靠信号放大方法，用于检测外泌体。通过检测不同类型的外泌体，发现EpCAM蛋白可能在乳腺癌外泌体中过度表达，并且不同类型外泌体的表达也存在差异。因此，该方法能够特异性地区分来自不同癌细胞来源的外泌体。

CRediT作者贡献声明

陈宇海：撰写——原始稿件、方法学设计、数据管理。薛瑞杰：实验研究、数据管理。张胜义：撰写——原始稿件、实验研究。叶梦颖：方法学设计、实验研究。赵京金：撰写——审稿与编辑、资金获取、概念构思。

利益冲突声明

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致谢

感谢国家自然科学基金（项目编号：22376040）和广西八桂青年拔尖人才项目的财政支持。