高灵敏度且便携的数字微流控技术，用于现场定量分析土壤中的微生物数量

《Talanta》：Highly sensitive and portable digital microfluidics for on-site quantitative analysis of soil microbial counts

精准量化土壤微生物对揭示其生态功能至关重要，但传统培养法易受“不可培养”微生物影响。数字PCR（dPCR）技术可实现绝对定量，但滴式dPCR（ddPCR）依赖复杂流体控制系统，限制其便携性。本研究开发了一种无需滴式生成设备的简化dPCR芯片，通过毛细作用自主分区样本，消除外部泵压需求，并采用铝合金热循环舱实现高效温控，总检测时间约1.5小时。使用枯草芽孢杆菌168作为模型，验证其检测线性范围（102-10? CFU/mL，R2=0.996）和最低检测限（102 CFU/mL），并通过黑土、黄褐土和水稻土样本验证，获得稳定定量结果。该平台为现场快速检测土壤微生物提供了实用方案。

　　

孔一卓|张芳洲|杨宇|张晨琦|高泽航|刘波|冯世伦|张进

新疆维吾尔自治区喀什大学生命与地理科学学院，帕米尔高原生物资源与生态学重点实验室，喀什，844000，中国

摘要

精确量化土壤微生物对于理解其生态功能至关重要。然而，传统的基于培养的方法往往会产生偏差，因为大多数土壤微生物无法培养。尽管数字PCR（dPCR）可以实现绝对量化，但基于液滴的dPCR（ddPCR）需要复杂的流体控制系统，这限制了其便携性和现场分析的适用性。为了解决这些限制，我们开发了一种简化的dPCR芯片和检测系统，无需使用液滴生成设备。通过毛细作用实现自主样品分配，从而消除了对恒压泵等辅助组件的需求，降低了系统复杂性和成本。采用高导热性的铝合金热循环室，使得PCR扩增和荧光检测可以在大约1.5小时内完成。使用Bacillus subtilis 168作为模型生物，该平台在10²-10⁵ CFU/mL的范围内表现出良好的定量线性（R² = 0.996），并能够可靠地检测低至10² CFU/mL的目标浓度。该系统还使用真实土壤样本进行了验证，包括黑土、潮土和水稻土，分别测得细菌丰度为（1.54 ± 0.49）× 10³ CFU/g、（1.49 ± 0.49）× 10³ CFU/g和（0.85 ± 0.25）× 10³ CFU/g。该平台为土壤微生物的快速、灵敏的现场量化提供了一种实用方法，支持从实验室分析向现场监测的转变。

引言

土壤微生物的组成是调节养分循环、维持土壤肥力和推动植被生产力的关键因素[1]。精确量化它们在野外的丰度对于阐明它们在碳和氮循环、重金属转化以及有机污染物降解等过程中的生态作用至关重要[2,3]。先前的研究表明，不同功能组土壤微生物的动态变化可以作为土壤质量、农田退化程度和生态系统恢复能力的重要指标[4,5]。在这些微生物中，B. subtilis 168通过分泌功能性酶、调节根际微环境和竞争性生态位占据，可以显著增强作物的抗逆性和土壤系统的稳定性[6,7]。因此，开发高度敏感、快速且可在野外使用的土壤微生物丰度量化方法对于实现便携式的现场微生物分析至关重要，从而支持精准农业和土壤生态管理。

在环境分析和涉及复杂样本的研究中，色谱技术——特别是高效液相色谱（HPLC）——由于其高分离效率和可靠的量化性能，已被广泛用于天然产物、手性化合物和生物活性分子的分析和鉴定[[8], [9], [10], [11]]。然而，这些方法通常消耗大量有机溶剂，需要劳动密集型的复杂样品制备，并依赖于笨重、复杂的仪器。因此，它们的能源效率、操作便利性和野外适用性受到限制，不太适合快速、低消耗的现场环境样本分析。

目前，微生物检测的主要策略包括基于培养的方法[12]、免疫学检测[13]、分子生物学技术[14]和基于生物传感器的方法[15]。基于培养的方法由于成本低和操作简单而被广泛使用；然而，它们耗时、劳动密集，并且无法检测“可存活但不可培养”（VBNC）状态的微生物，常常导致假阴性结果和活细胞计数的低估[16,17]。免疫学技术依赖于抗原-抗体相互作用，具有高特异性和灵敏度，但需要复杂的抗体制备，且重现性较差[18,19]。基于生物传感器的方法提供可视读数和用户友好的操作；然而，它们的性能经常受到高设备成本和环境波动的影响[[20], [21], [22]]。分子生物学方法，如聚合酶链反应（PCR）、核酸测序和杂交，能够在核酸水平上进行高度特异性的微生物检测[23,24]。特别是实时定量PCR（qPCR）通过将荧光强度与核酸拷贝数相关联，实现微生物的相对量化，从而实现快速检测[25,26]。例如，张等人开发了一种三重qPCR检测方法，用于监测废水中的Campylobacter jejuni和Campylobacter coli，检测限达到10拷贝/μL[27]。尽管如此，qPCR依赖于标准曲线，其准确性受扩增效率和抑制物质的影响，这限制了其对低拷贝数核酸的检测能力[28]。

数字PCR（dPCR）作为第三代PCR技术，在近年来得到了快速发展和广泛应用[29]。该技术将反应混合物分成数万个纳升级别的单元，导致核酸分子的随机分布。通过扩增后计数阳性单元并应用泊松统计，实现了单分子水平的绝对量化[30]。与qPCR相比，dPCR具有更高的灵敏度[31]、重现性[32]和定量准确性[33]，特别是对于低浓度目标。根据样品分配策略，dPCR可以分为基于腔室的（cdPCR）和基于液滴的（ddPCR）格式[34,35]。虽然ddPCR具有高通量，但其实际应用受到热循环过程中液滴不稳定性（例如破裂或融合）和依赖昂贵液滴生成设备的限制。相比之下，cdPCR使用物理隔离的微腔室进行独立扩增，有效减少了信号干扰，确保了定量准确性和结果稳定性。例如，崔等人开发了一种基于PDMS真空密封和空气冲洗的数字芯片，在5分钟内实现了90%的样品利用率和高通量分配[36]。同样，沈等人设计了一种带有集成微反应腔室的数字PCR芯片，结合单次大场成像和高均匀照明，实现了肺癌DNA的高灵敏度量化[37]。这些研究表明，cdPCR对于低浓度样本提供了出色的灵敏度和稳定性，为环境和微生物量化提供了有前景的方法。然而，cdPCR芯片的高制造成本和操作复杂性仍然是其在快速现场检测中应用的主要障碍。

为了解决这些挑战，本研究提出了一种基于玻璃微孔阵列的无泵数字微流控系统（图1）。微腔阵列芯片通过毛细驱动的自加载和简单的刮擦分配策略实现自动化纳升级试剂分配，消除了对外部泵或复杂流体控制的需求。与基于Peltier的温度控制模块集成的铝制热传递室提供了精确的温度调节，将整体检测时间缩短至大约1.5小时。结合紧凑的荧光成像模块，该系统构成了一个便携式的快速分析平台。使用这个集成系统，实现了对土壤样本中B. subtilis 168的灵敏和可重复的绝对量化，检测限为10² CFU/mL，证明了其在复杂样本条件下对土壤微生物的现场和实时评估的适用性。

材料

矿物油、Triton X-100和无菌甘油购自Titan Technology（上海，中国）。聚二甲基硅氧烷（PDMS，Sylgard 184）购自Dow Corning（美国）。显微镜载玻片购自Shitai Labware（江苏，中国），硅片购自Zixi Electronics（上海，中国）。细菌基因组DNA提取试剂盒购自Tiangen Biotech（北京，中国），基于玻璃的微孔阵列板购自Irwinte

cdPCR材料和结构的优化

为了优化微流控cdPCR平台的加载基底，本研究探讨了三种不同材料（铝、玻璃和硅）的导热性和温度稳定性，并评估了它们在cdPCR应用中的适用性。结构配置包括PDMS粘合的玻璃（图3a）、PDMS粘合的硅（图3b）和基于铝的基底（图3c）。这些材料的导热性能有显著差异。图3d展示了导热性能

结论

本研究提出了一个无泵的cdPCR微流控平台，用于土壤微生物的绝对量化。该平台解决了传统cdPCR系统的关键限制，包括复杂的液滴生成和对外部流体控制的依赖。高密度玻璃微孔阵列实现了自主的、毛细驱动的样品加载，简化了系统配置并降低了交叉污染风险。将蜂窝微腔阵列与铝合金集成

CRediT作者贡献声明

孔一卓：写作——审稿与编辑，原始草稿写作。张芳洲：写作——审稿与编辑。杨宇：方法学。张晨琦：资源获取、资金筹集。高泽航：资源获取、资金筹集。刘波：资源获取、资金筹集。冯世伦：写作——审稿与编辑、项目管理。张进：写作——审稿与编辑、项目管理。

资助

本研究得到了青海省科学技术厅关键研究与开发转化计划资助（项目编号：2025-QY-208）。国家关键研究与发展计划（项目编号：2023YFA0915200、2023YFA0915204）。中国科学院的设备研究与发展项目（项目编号：PTYQ2024YZ0010、PTYQ2024BJ0007）。上海市科学技术委员会项目（项目编号：

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

我们衷心感谢使这项研究成为可能的非作者合作者们的宝贵贡献。