《Talanta》：Smartphone-integrated time-resolved fluorescent lateral flow immunoassay for sensitive and on-site detection of thiamphenicol and florfenicol
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时间分辨荧光微球结合侧流免疫层析法与智能手机荧光分析仪联用，灵敏检测猪鸡鱼中替米沙星和氟苯尼考残留，检测限达0.02 ng/mL，灵敏度较传统金纳米颗粒法提升近30倍，加标回收率82.72%-116.50%，变异系数<13%。
宋思毅|邱玉楼|董文毅|刘婉婉|朱宇涛|邱佳|张标|沈图旭平|叶志宏|余小萍
中国计量科学研究院微生物计量、测量与生物产品质量安全重点实验室，国家市场监督管理总局，浙江吉利学院，杭州，310018，中国
摘要
动物源性食品中的噻吩卡巴霉素（TAP）和氟苯尼考（FF）残留对人类健康构成相当大的威胁。因此，开发一种快速且灵敏的检测方法至关重要。本研究建立了一种基于时间分辨荧光微球和侧向流动免疫分析（TRFM-LFIA）的技术，并结合了智能手机便携式荧光分析仪，用于快速灵敏地检测食品中的TAP和FF。在最佳条件下，TRFM-LFIA对TAP和FF的检测限为0.02 ng/mL，比传统的基于金纳米粒子的侧向流动免疫分析方法的灵敏度高29.5倍和19.5倍。在实际样品中，TAP和FF的回收率分别为82.72%–114.10%和103.78%–116.50%，变异系数小于13%。这些结果表明，结合智能手机的TRFM-LFIA可以作为一种有效的工具，用于现场检测动物源性食品中的TAP和FF。
引言
抗生素残留已成为全球范围内的重大公共卫生问题。噻吩卡巴霉素（TAP）和氟苯尼考（FF）是合成广谱抗生素，广泛用于畜牧业、家禽业和水产养殖业，用于预防和治疗细菌感染，如肠道和呼吸道感染[1]，[2]。然而，TAP和FF具有毒性作用，包括血液毒性、胚胎毒性、神经毒性和免疫抑制作用[3]，[4]。这些抗生素在动物源性食品中的存在对人类健康构成潜在风险。欧盟和中国分别对TAP及其主要代谢物氟苯尼考胺（FFA）在动物源性食品中的最大残留限量设为50 μg/kg和100–3000 μg/kg[5]，[6]。因此，开发一种快速灵敏的检测方法对于监测和监管食品中的TAP和FF非常重要。
迄今为止，已经建立了多种分析方法来检测TAP和FF，包括气相色谱（GC）、气相色谱-质谱（GC–MS）、高效液相色谱（HPLC）、液相色谱-串联质谱以及酶联免疫吸附测定（ELISA）[7]，[8]，[9]，[10]，[11]。尽管这些方法可靠且灵敏，但它们操作复杂、检测时间较长，并且需要熟练的操作人员和先进的仪器。为了实现快速现场检测，人们开发了新的生物传感策略，例如石墨烯光电化学晶体管（GPECT）[12]，[13]。这些平台在受控环境中表现出高灵敏度和信号切换能力，但其复杂性往往阻碍了实际应用。侧向流动免疫分析（LFIA）是一种基于抗原和抗体特异性识别的常见免疫分析方法，具有简单、快速和成本效益高的优点，适用于快速现场检测[14]，[15]，[16]。然而，传统的基于金纳米粒子的LFIA（AuNP-LFIA）存在灵敏度低和无法进行定量分析的局限性[17]，[18]。
许多荧光材料，包括量子点、上转换纳米粒子、荧光蛋白和镧系离子，已被用来替代传统的金纳米粒子以提高LFIA的灵敏度[19]，[20]，[21]，[22]，[23]。在这些荧光材料中，镧系元素（如铕）因其高荧光强度、较大的斯托克斯位移、窄的发射带和强的抗背景干扰能力而备受青睐[24]，[25]。时间分辨荧光微球（TRFMs）是通过将大量镧系元素嵌入聚苯乙烯（PS）微球中制备的，显著增强了荧光强度和检测灵敏度[26]。此外，聚苯乙烯外壳可以封装镧系螯合物，减少外部环境的影响，从而提高TRFMs的稳定性[27]，[28]。TRFMs表面的功能基团还可以实现抗体的共价结合，提高信号探针的稳定性[29]，[30]。
在本研究中，合成了具有高荧光强度的羧基功能化TRFMs，并将其与抗TAP单克隆抗体（mAb）共价偶联，用作检测探针。然后开发了一种TRFM-LFIA方法来检测TAP和FF残留（图1）。荧光信号可以通过智能手机便携式荧光分析仪快速定量检测。评估了该方法的灵敏度、线性范围和特异性。此外，该方法还应用于猪肉、鸡肉和鱼的实际样品检测，并通过HPLC进行了验证。结合智能手机的TRFM-LFIA可能为动物源性食品中TAP和FF的检测提供一个可靠的平台。
材料
TAP、FF、氯霉素（CAP）、FFA、桑德拉霉素（AM）、庆大霉素（GM）、2-(N-吗啉基)乙烷磺酸（MES）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺（EDC）、乙醇、甲醇、乙腈、苯乙烯、甲基丙烯酸、六水合氯化铕（EuCl3·6H2O）、4,4,4-三氟-1-(2-萘基)-1,3-丁二酮（NTA）、1,10-菲罗啉（phen）、硼酸、n-己烷、乙酸乙酯、氢氧化铵和无水硫酸钠均从Aladin购买
TRFMs和TRFM-mAb探针的表征
通过透射电子显微镜（TEM）研究了合成的TRFMs的结构特性。图2A和2B显示，TRFMs呈现均匀分布的球形颗粒，尺寸一致，表面光滑，无明显聚集现象。在自然光下呈白色，在紫外光下发出强烈的红色荧光，最大发射波长为614 nm（图2C）。TRFMs的红外光谱见
结论
本研究成功合成了具有高荧光强度的羧基功能化TRFMs，并将其与抗TAP mAb共价偶联作为信号探针。经过实验条件优化后，建立了结合智能手机便携式荧光分析仪的TRFM-LFIA方法，用于灵敏且现场检测TAP和FF。该方法对TAP和FF的检测限为0.02 ng/mL，比传统方法灵敏度高29.5倍和19.5倍
CRediT作者贡献声明
朱宇涛：软件开发。刘婉婉：数据分析。董文毅：方法学研究。邱玉楼：写作 – 审稿与编辑、初稿撰写、方法学设计、概念构思。宋思毅：初稿撰写、方法学研究、数据管理。余小萍：项目监督、资源协调。叶志宏：项目监督、实验设计。沈图旭平：数据可视化、数据管理。张标：方法验证。邱佳：实验实施
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
本研究得到了国家重点研发计划（2022YFF1101000）和浙江省自然科学基金（LMS25C200001）的支持。
