一种基于组织内平行衍生化技术的20-美拉拉嗪衍生物方法，用于成像成年斑马鱼中的脂肪酸过氧化产物

《Analytica Chimica Acta》：An on-tissue parallel d 0/d 20-meladrazine derivatization approach for fatty acid peroxidation products imaging in adult zebrafish

本研究开发了一种新型水凝胶辅助在组织上化学衍生化方法（HCD），结合d0/d20-meladrazine平行标记与AFADESI-MSI技术，成功鉴定和标注了斑马鱼体内313种脂质过氧化产物（FAPPs），包括176种醛类和137种氧化脂肪酸。优化条件为4℃和2 mg/mL低浓度试剂，兼容生物样本完整性。该方法应用于Congo红暴露斑马鱼，发现肠道、肝脏和大脑中FAPPs失调，揭示CR诱导氧化应激的神经毒性和肝毒性。该工具为环境污染物毒性机制研究提供新方法。

　　

作者：季阳、孙月、李月明、王中华、Zeper Abliz、周志

质谱成像与代谢组学重点实验室（中国民族大学），国家民族事务委员会，北京100081，中华人民共和国

摘要

背景

质谱成像（MSI）能够同时获取生物组织中多种分子的空间分布、丰度和结构信息，但在检测难以电离或低丰度分析物时面临固有挑战。脂肪醛（FALs）和氧化脂肪酸（oxo-FAs）作为脂肪酸过氧化产物（FAPPs）的关键亚类，在生理和病理学上具有重要意义。然而，它们的质谱检测仍然是一个重大挑战，尤其是在生物组织切片中的原位脱附和分析方面。

结果

开发了一种新型的水凝胶辅助组织内化学衍生化（HCD）方法，该方法结合了d₀/d₂₀-meladrazine平行标记技术和气流辅助脱附电喷雾离子化-质谱成像（AFADESI-MSI）。通过系统优化水凝胶类型、反应时间、反应温度和衍生化试剂浓度，成功识别并标注了313种成年斑马鱼中的FAPPs，其中包括176种FALs和137种oxo-FAs。值得注意的是，衍生化过程在4°C下进行，且试剂浓度低至2 mg/mL，这种方法既有效又更有利于保持生物样本的完整性。此外，还编写了自定义的R脚本，以便快速识别和匹配对应于衍生产物的同位素标记峰对。将这种方法应用于斑马鱼全身切片后，获得了237种FAPPs的空间分布图。进一步使用Congo red（CR）处理斑马鱼的研究显示，FAPPs的失调表明CR引起了肠道、肝脏和大脑的氧化应激损伤。

意义

本研究为成年斑马鱼中FAPPs的原位可视化提供了一种有效工具，其在水污染物暴露研究中的应用为CR的神经毒性和肝毒性提供了直接证据。该方法具有广泛的应用潜力，可适用于其他生物组织，并有助于阐明环境毒素的毒性机制或与氧化应激相关的疾病机制。

引言

质谱成像（MSI）技术可以提供生物组织样本中多种分子的空间分布、相对丰度和结构信息[1]、[2]。尽管该技术对生物分子的检测范围比其他化学成像技术更广，但由于某些化合物的结构难以电离或丰度较低（如类固醇激素[3]、[4]、N-糖胺[5]和儿茶酚胺衍生物[6]），其质谱（MS）检测仍存在挑战。因此，越来越多的研究致力于开发组织内化学衍生化（OTCD）方法以实现其原位表征[7]。

一方面，根据目标分子的具体官能团合成了多种衍生化试剂，包括对氨基、羰基和羧基的衍生化，以及脂质异构体中的碳-碳双键的衍生化。特别是某些衍生化试剂同时作为基质辅助激光脱附/离子化质谱成像（MALDI-MSI）分析中的基质，从而简化了实验过程[8]。常见的Girard试剂可以添加到羰基化合物中，引入一个带正电荷的季胺基团，从而提高中性皮质类固醇[4]、胆固醇[9]、外源性类固醇药物[10]和萜类植物激素[11]在MSI分析中的灵敏度。基于肼的衍生化试剂已成为针对含羰基代谢物的多功能类别，利用肼基（-NH-NH₂）对醛类/酮类的高反应性形成稳定的腙加合物。例如，Tie等人报道了一种高效的试剂2,4-双（二乙氨基）-6-肼基-1,3,5-三嗪（meladrazine，CAS 13957-36-3），在温和条件下可将血浆样本中超过98%的FALs转化为衍生物[12]、[13]。

另一方面，衍生化试剂的涂层方法不仅影响OTCD的效率，还显著影响MSI结果；因此这是一个值得研究的创新点。大多数情况下，使用喷雾器或喷墨打印机进行喷涂是一种常见且简单的方法。喷雾装置也基于电喷雾原理设计，以生成微小且均匀的颗粒[14]。无溶剂的方法如升华法较少用于衍生化试剂的涂层，因为含有溶剂时反应效率更高[15]。然而，上述方法的最大限制是衍生化试剂的过量使用。已经开发出一种通用的水凝胶辅助化学衍生化（HCD）方法[16]，其中明胶作为Girard P试剂的负载介质。由于其“覆盖/揭开”接触模式，可以去除多余的试剂，且未观察到分子位移。

脂肪醛（FALs）和氧化脂肪酸（oxo-FAs）正是需要衍生化预处理的化合物类别，以便进行质谱检测。这两种化合物属于非酶促脂肪酸过氧化产物（FAPPs），在生理和病理学上具有重要意义。研究表明，FALs在信号通路和细胞代谢中起调节作用[17]。然而，FALs的积累被认为是Sj?gren–Larsson综合征（SLS）的发病机制，该综合征会损害皮肤和神经系统的关键功能[18]、[19]。Oxo-FAs通过氧化或肠道微生物代谢增强抗氧化或解毒防御过程[20]，刺激脂肪生成[21]，并有助于改善代谢紊乱，如糖尿病[22]和心血管疾病[23]、[24]、[25]。鉴于脂质过氧化与氧化应激之间的密切关系，检测FAPPs为理解许多疾病的机制和污染物毒性评估提供了关键线索[26]、[27]、[28]。

偶氮染料是一种重要的合成染料，占全球年产量的50%以上[29]、[30]。然而，其非法使用和排放不仅严重破坏水、土壤和整个生态环境，还可能威胁人类健康，包括致癌性、致畸性和致突变性风险。Congo red（CR）属于联苯胺偶氮染料类，历史上被用作服装染料、实验室指示剂以及化妆品和食品中的成分[31]、[32]，其毒性研究自然引起了关注[33]、[34]。已有研究利用MSI技术评估污染物的毒性，例如地西泮副产物和1-硝基芘[35]、[36]、[37]。然而，从使用MSI技术扰动FAPPs的角度研究CR暴露的影响尚未报道。

此前，已经建立了一种基于气流辅助脱附电喷雾离子化（AFADESI）MSI的成年斑马鱼空间分辨代谢组学方法，并系统优化了冷冻切片制备和分析平台的参数[38]。在此基础上，本研究开发了一种新的HCD衍生化方法，该方法采用d₀/d₂₀-meladrazine平行标记技术。为了确定最佳效率，研究了关键的衍生化条件，包括水凝胶类型、反应时间、反应温度和试剂浓度。实现FALs和oxo-FAs的准确和高覆盖率可视化，有望为全面了解成年斑马鱼的空间代谢组提供补充信息。为了展示其在环境污染物评估研究中的可用性，该方法被应用于可视化暴露于CR的成年斑马鱼中的FAPPs异常，为CR的毒性机制提供了新的分子信息。

试剂和材料

衍生化试剂meladrazine（化学式：C₁₁H₂₃N₇）和d₂₀-meladrazine（化学式：C₁₁H₃D₂₀N₇）由深圳科赛化学生物科技有限公司合成。高效液相色谱（HPLC）级甲醇购自默克（Merck，德国），HPLC级甲酸购自Tedia（美国俄亥俄州费尔菲尔德），纯净水购自娃哈哈（中国杭州）。标准化合物购自Aladdin（美国密苏里州圣路易斯）。

原位衍生化方法的建立

由于之前尚未对成年斑马鱼冷冻组织样本进行水凝胶辅助的原位衍生化研究，首先研究了不同类型的水凝胶。将0.3 μL的混合标准溶液分别放置在组织匀浆切片的上左角和上右角，其中左侧进行衍生化处理，右侧作为对照（图1A）。如图1B所示，在三种测试浓度下，琼脂糖的表现优于明胶。

结论

总之，开发了一种结合水凝胶辅助原位处理和同位素标记衍生化的新型AFADESI-MSI方法，用于分析成年斑马鱼中的FAPPs。通过系统优化衍生化条件并结合R语言编程，该方法表现出高效率、温和性和高覆盖率（176种FALs和137种oxo-FAs）。这种全新的meladrazine-琼脂糖组合为HCD系统提供了新的选择工具。

CRediT作者贡献声明

李月明：研究工作。 王中华：写作 – 审稿与编辑。 Zeper Abliz：写作 – 审稿与编辑，资金获取。 周志：监督，项目管理，资金获取。 季阳：写作 – 初稿撰写，数据管理。 孙月：方法学设计，数据分析。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究工作。

数据可用性

在线版本包含网站上的补充材料。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究工作。

致谢

作者感谢国家自然科学基金（编号：21927808和82003714）和中国民族大学（编号：2024XSYL01）的支持。