建立一种用于定量检测总I型前胶原N端前肽的均质免疫测定方法

《Analytical Biochemistry》：Establishment of a homogeneous immunoassay for quantitative detection of total procollagen type 1 N-terminal propeptide

建立基于LiCA技术的总P1NP定量检测方法，优化抗体对及反应条件，评估其精密度（CV 4.20%-9.37%）、灵敏度（LoQ 3.83 ng/mL）和线性范围（5.88-1447.65 ng/mL），并与罗氏ECLIA方法（r=0.8969）对比验证临床可靠性，为骨代谢标志物检测提供低成本替代方案。

　　

程珊珊|孙远民|杨晓辉|杨宏伟|崔晓明|李雪|李慧强|余阳

摘要

目的

建立一种均一的免疫测定方法，用于定量检测人血清中的总前胶原1型N端前肽（P1NP）。

方法

在筛选原材料并优化反应条件后建立了该测定方法，并根据临床指南评估了其性能。同时，将所建立方法的检测结果与罗氏电化学发光免疫测定方法的结果进行了比较。

结果

变异系数为4.20%～9.37%，中间精密度为6.20%～9.80%。空白限（LoB）为1.14 ng/mL，定量限（LoQ）为3.83 ng/mL。线性范围为5.88 ng/mL～1447.65 ng/mL。所建立的总P1NP-LiCA方法与罗氏ECLIA方法的结果之间的相关系数（r）为0.8969。

结论

开发了一种均一的定量免疫测定方法，可用于常规临床评估骨形成标志物，具有实用性和成本效益。

引言

前胶原1型N端前肽（P1NP）是成骨细胞在合成1型胶原过程中的产物，是新骨形成的敏感指标[1]。血清P1NP水平的升高提示骨生成活性增强，这种情况常见于原发性甲状旁腺功能亢进症、佩吉特病、伴有骨转移的恶性肿瘤以及绝经后骨质疏松症等，因此可以作为这些疾病的敏感诊断和监测指标[[2], [3], [4], [5], [6], [7]]。

目前，仅有少数方法可用于检测血清P1NP，包括化学发光免疫测定（CLIA）[8]、放射免疫测定（RIA）[9]和电化学发光免疫测定（ECLIA）[10]。尽管RIA具有可接受的灵敏度，但其常规临床应用受到放射性危害、复杂的手动操作程序和有限通量的限制。传统的CLIA方法虽然实现了自动化，但通常需要多次洗涤或分离步骤来减少背景干扰，并且分析测量范围相对较窄。以罗氏ECLIA为代表的方法因其能够同时检测完整和单体化的P1NP以及较高的分析性能而被广泛认为是金标准。然而，该平台严重依赖专用仪器和专利试剂，导致运营成本较高，许多临床实验室难以使用。

为了克服这些限制，迫切需要一种更易获取、高性能且简化的检测平台。光诱导化学发光测定（LiCA）是一种“无需分离”的方法，通过抗原-抗体反应将高能活性氧转移到标记有发光物质或光敏物质的微球上[11]。与传统的不均相测定方法不同，LiCA消除了复杂的洗涤和分离步骤，从而减少了基质干扰并缩短了检测时间[[12], [13], [14], [15]]。此外，该反应的均一性使得动态范围更广，所需样本量更少。

在本研究中，建立了一种基于LiCA的人血清总P1NP定量检测的新均一免疫测定方法。优化了反应条件和高亲和力抗体对，并根据临床指南严格评估了该方法的性能，包括精确度、灵敏度和线性。此外，还与罗氏ECLIA系统进行了方法比较，以验证其临床可靠性。

样本

所有血清样本均来自天津医院，并在罗氏Cobas? e411分析仪上进行检测。样本按照试剂说明在-20°C下采集和冷冻，冷冻和解冻次数不超过5次。本研究遵循赫尔辛基宣言进行，并获得了天津医院伦理委员会的批准（批准编号2024-037）。

试剂和设备

重组人P1NP蛋白由MDTK生物技术有限公司（北京）提供。

抗体对筛选

如图1所示，Fb-1 + Bio-7抗体对在550 ng/mL时具有最高的信噪比（图1A）。同时，该抗体对在不同浓度下的信噪比也表现良好（图1B）。图1C表明所选的校准品（重组抗原）与天然抗原具有相同的反应性，理论浓度值的对数与相应CL信号值的对数的回归方程和相关系数为y = 1.146。

方法比较

结果显示，本研究建立的总P1NP LiCA方法与罗氏电化学发光测定方法在检测总P1NP方面具有良好相关性。回归方程和相关系数分别为y = 0.6433x + 49.96和r = 0.8969（图6A），LiCA与罗氏方法之间差异的Bland-Altman检验结果见图6B。根据数据，LiCA与罗氏方法之间的平均偏差为71.74。

讨论

总P1NP是监测骨质疏松症治疗的临床重要生物标志物，可用于评估骨折风险和监测骨质疏松症治疗的效果[2,6,7]。因此，总P1NP的检测需要较宽的测量范围[22]。然而，中国临床实验室中可用的P1NP检测方法很少，且部分方法成本较高。因此，在本研究中基于LiCA建立了一种双抗体夹心P1NP测定方法。

在本研究中，捕获抗体的包被浓度...

结论

总之，本研究成功建立了总P1NP-LiCA方法。该方法具有宽广的动态范围、较小的样本需求和稳健的分析性能，使其成为常规临床评估骨形成标志物的实用且成本效益高的选择。

作者贡献声明

程珊珊：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原始草稿。孙远民：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原始草稿。杨晓辉：数据管理。杨宏伟：数据管理。崔晓明：研究工作，数据管理。李雪：研究工作，数据管理。李慧强：概念构思。余阳：概念构思。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。