《Biological Control》：Biocontrol of Chrysanthemum wilt by
Bacillus velezensis HSX-1 and its antifungal mechanism
编辑推荐：
本研究聚焦于由尖孢镰刀菌引起的、造成重大经济损失的菊花枯萎病。为解决化学防治带来的诸多问题，研究人员分离鉴定了贝莱斯芽孢杆菌HSX-1菌株，通过离体与活体实验证实其可高效抑制病原真菌菌丝生长与孢子萌发，并显著促进菊花生长。基因组与转录组分析揭示了其通过产生活性次级代谢物、水解酶以及破坏病原菌细胞膜与活性氧清除系统等多重机制发挥生防作用。该研究为开发高效、环保的菊花病害生物防治制剂提供了新策略。
菊花，作为兼具观赏与药用价值的重要经济作物，在全球范围内广受欢迎。然而，在其栽培过程中，一种名为枯萎病的病害常如“隐形杀手”般肆虐，其元凶尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)能导致植株萎蔫、黄化甚至死亡，造成严重的产量与品质损失，带来巨大的经济损失。目前，对于菊花枯萎病的防治，主要依赖于化学杀菌剂。但长期大量使用化学农药，不仅导致病原菌产生抗药性，还会造成农药残留、土壤生态恶化和食品安全等问题，亟待寻找更安全、可持续的解决方案。生物防治剂以其对人类安全和环境友好的特性，成为近年来研究的热点。其中，芽孢杆菌(Bacillus)属因其能分泌多种抑制植物病害并促进植物生长的化合物，被视为农业领域最具潜力的生防菌属之一。尽管芽孢杆菌在多种作物病害的生物防治中已被广泛研究，但针对其防治菊花枯萎病的深入探索仍显不足。因此，发掘高效、兼具促生功能的生防菌株，并阐明其作用机理，对于推动菊花的绿色、无公害生产具有重要的理论与应用价值。近期，一篇发表在《Biological Control》上的研究论文，为我们带来了一株具有强大潜力的“植物守护者”——贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis) HSX-1，并系统揭示了其对抗菊花枯萎病的“多重武器”。
为了探究HSX-1菌株的生防潜力与作用机制，研究人员采用了多种关键技术方法。首先，从健康菊花植株根部分离内生细菌，并通过与病原菌的共培养进行初筛，确定了抑菌效果最强的HSX-1菌株。其次，通过测定无细胞上清液对病原菌菌丝生长和孢子萌发的影响，评估其抗菌活性。接着，利用全基因组测序对HSX-1进行物种鉴定，并分析其编码次级代谢物和水解酶的相关基因簇。同时，通过表型实验检测了该菌株产吲哚-3-乙酸和铁载体的能力。在活体水平，通过离体叶片接种试验和盆栽试验，验证了HSX-1对菊花枯萎病的防治效果及促生长作用。为深入解析其抑菌分子机制，研究人员对经HSX-1无细胞上清液处理的病原菌进行了转录组测序分析，并结合碘化丙锭和DCFH-DA染色，从细胞膜完整性和活性氧积累两个层面探究了其作用靶点。研究样本中的HSX-1菌株和病原菌尖孢镰刀菌均于2024年秋季采集自中国黄山市的菊花植株。
1. 菌株HSX-1对病原尖孢镰刀菌的拮抗活性
研究人员首先从患病的菊花中分离并分子鉴定了病原菌尖孢镰刀菌。通过对菊花健康根部内生芽孢杆菌的初筛，发现菌株HSX-1对该病原菌表现出最强的拮抗活性。离体拮抗试验表明，HSX-1能有效抑制病原菌生长。具体而言，对峙培养试验显示，HSX-1可抑制病原菌菌丝生长高达65.52%。HSX-1的无细胞上清液同样表现出强抗真菌活性，15%浓度的上清液处理可抑制病原菌菌丝生长63.47%，并显著抑制尖孢镰刀菌孢子萌发达63.13%。这些结果初步表明菌株HSX-1具有抑制尖孢镰刀菌的优异潜力。相关实验数据直观展示在中。
2. 菌株HSX-1的遗传特征
为了从遗传基础上理解HSX-1的生防能力，研究人员对其进行了全基因组测序。HSX-1的完整基因组大小为3,975,832 bp，GC含量为46.25%，包含3,875个蛋白质编码基因。通过系统发育分析，确定HSX-1与贝莱斯芽孢杆菌亲缘关系最近，从而将其鉴定为贝莱斯芽孢杆菌。利用antiSMASH工具分析发现，HSX-1基因组中包含16个与次级代谢物合成相关的基因簇，包括负责生产表面活性素、丰原素、杆菌溶素、杆菌杆菌素等已知抗菌物质的基因簇，以及四个与已知簇相似性不高的基因簇，表明其可能具有合成新型抗菌化合物的遗传潜力。此外，基因组分析还发现HSX-1编码了127个碳水化合物活性酶基因，包括几丁质酶、内切-β-1,4-葡聚糖酶、内切-β-1,3–1,4-葡聚糖酶和肽聚糖裂解酶等水解酶基因，提示其具备通过降解真菌细胞壁来抑制病原菌生长的能力。基因组环形图谱与系统发育树见。
3. 菌株HSX-1的植物促生长特性
许多芽孢杆菌能够产生植物生长激素吲哚-3-乙酸(IAA)以促进植物生长。本研究发现，HSX-1菌株具备产生IAA的能力。结晶紫染色显示HSX-1具有优异的生物膜形成能力。此外，在铬天青S琼脂平板上，菌落周围出现橙黄色晕圈，表明HSX-1能够合成铁载体。铁载体能够螯合根际铁元素，减少病原菌对铁的利用，同时促进植物对铁的吸收和利用，从而保护植物免受病原菌侵袭。值得注意的是，基因组分析揭示HSX-1含有一个杆菌杆菌素合成基因簇，这是一种由某些芽孢杆菌产生的铁螯合化合物。这些发现共同证明菌株HSX-1具有优秀的植物促生长潜力。相关表型实验结果展示于。
4. 菌株HSX-1对菊花枯萎病的生防功效
研究人员通过离体叶片试验评估了HSX-1菌株对尖孢镰刀菌的生防功效。结果显示，与仅接种病原菌的对照组相比，同时接种HSX-1菌悬液和病原菌菌丝块的叶片，其病斑直径显著减小。盆栽试验进一步证明，HSX-1处理使病害严重度降低了94.74%，显著减轻了尖孢镰刀菌在菊花上引起的症状。仅接种病原菌的植株出现严重的萎蔫症状，而同时用HSX-1和病原菌处理的植株病害症状明显减轻。此外，HSX-1还能显著促进菊花生长。接种HSX-1的植株在所有处理组中生长最佳，其地上部分长度比对照增加了112.5%。即使在病原菌挑战下，经HSX-1处理的植株也比仅感染病原菌的对照植株生长得更好。这些结果凸显了HSX-1在防治尖孢镰刀菌以及促进菊花生长方面的强大潜力。生防效果与促生长作用见。
5. 菌株HSX-1抗尖孢镰刀菌的作用机制
为阐明HSX-1拮抗尖孢镰刀菌的作用机制，研究人员研究了其无细胞上清液对活性氧积累和细胞膜完整性的影响。活性氧稳态在真菌发育和侵染寄主植物过程中起着关键作用。通过DCFH-DA染色检测发现，与对照组相比，经HSX-1无细胞上清液处理的真菌样品显示出更强的绿色荧光信号，表明HSX-1诱导了尖孢镰刀菌细胞内活性氧的积累，可能导致氧化应激和细胞死亡。同时，碘化丙锭染色评估了HSX-1对尖孢镰刀菌细胞膜完整性的影响。结果显示，经上清液处理的真菌样品表现出强烈的红色荧光，而对照组未检测到荧光，表明HSX-1的无细胞上清液破坏了尖孢镰刀菌的细胞膜完整性。这些细胞层面的表型证据见。
为了从分子层面解析HSX-1的拮抗机制，研究人员通过转录组测序比较了经HSX-1无细胞上清液处理和未处理真菌样品的基因表达谱。差异表达基因分析显示，处理组共有4899个基因表达发生显著变化，其中2317个基因上调，2582个基因下调。qRT-PCR验证了随机选择的10个差异表达基因，结果与RNA-seq数据一致。基因本体富集分析表明，上调基因显著富集在有机氮化合物生物合成过程、翻译、肽生物合成过程等；而下调基因则显著富集在跨膜运输、膜、氧化还原酶活性、过氧化物酶体膜运输等方面。京都基因与基因组百科全书通路分析进一步显示，上调基因显著富集在核糖体、氨酰-tRNA生物合成、氧化磷酸化等通路；而下调基因则显著富集在氮代谢、乙醛酸和二羧酸代谢以及过氧化物酶体通路。这些转录组学分析结果揭示，菌株HSX-1通过破坏细胞膜完整性、氧化还原酶活性和过氧化物酶体功能等多重细胞功能来抑制尖孢镰刀菌。详细的转录组分析结果汇总于。
结论与讨论
本项研究成功分离并鉴定了一株新的贝莱斯芽孢杆菌菌株HSX-1，证实其是防治菊花尖孢镰刀菌枯萎病的一种高效生防制剂。该菌株通过多种协同机制发挥强大的抑菌作用：其产生的次级代谢物（如表面活性素、丰原素、杆菌溶素）和水解酶（如几丁质酶、β-葡聚糖酶）直接攻击病原菌；通过破坏病原菌的细胞膜完整性，导致内容物泄漏；诱导病原菌细胞内活性氧过度积累，引发氧化损伤；并干扰其关键的代谢通路，如乙醛酸和二羧酸代谢以及过氧化物酶体功能，从而削弱病原菌的毒力。同时，HSX-1还展现出优秀的植物促生特性，能够合成吲哚-3-乙酸和铁载体，并形成生物膜，这有助于其在根际定殖并促进菊花植株生长。盆栽试验证实，HSX-1不仅能有效降低病害严重度，还能显著促进菊花生长。
这项研究的创新性和重要意义在于：首先，它为解决菊花枯萎病这一生产难题提供了一种高效、环保的生物防治新选择，有助于减少对化学农药的依赖。其次，研究从基因组、转录组、表型等多维度系统阐明了HSX-1菌株“抑菌”与“促生”的双重作用机制，为深入理解贝莱斯芽孢杆菌的生防功能提供了新的见解。最后，该研究鉴定的潜在作用靶点（如细胞膜完整性、活性氧清除系统、过氧化物酶体通路等）为未来开发针对尖孢镰刀菌的新型杀菌剂或生防工程菌提供了重要的分子靶标和理论依据。综上所述，贝莱斯芽孢杆菌HSX-1展现出了作为兼具病害防治与植物促生功能的“多面手”微生物制剂的巨大应用潜力，为菊花乃至其他作物的可持续农业实践奠定了坚实的基础。
