通过集成鱼骨形微流控技术的条形码，对膀胱癌外泌体生物标志物进行高通量筛选

《Biosensors and Bioelectronics》：High-throughput screening of bladder cancer exosome biomarkers by barcodes integrated herringbone microfluidics

膀胱癌早期诊断中，本研究开发了一种集成herringbone微流控结构与光子晶体编码微载体的微流控平台，通过微流控结构增强流体混合与微反应时间，结合光子晶体微载体的稳定结构颜色编码和扩大表面积特性，实现外泌体的高效富集与六种蛋白标志物的同步检测，显著提升临床诊断灵敏度与特异性。

　　

魏小伟|蔡丽君|李宁|方一乐|王静琳|朱叶飞

南京医科大学第二附属医院实验室医学中心，中国南京210011

摘要

膀胱癌（BC）是最常见的泌尿系统恶性肿瘤之一，具有较高的死亡率，因此迫切需要高效、无创的诊断方法。在这项研究中，我们开发了一种集成微流控平台，该平台结合了人字形混合器和光子晶体（PhC）编码的核心-壳层水凝胶微载体，用于高效富集外泌体并实现多重生物标志物的检测。核心-壳层水凝胶微载体具有稳定的结构颜色编码，不受实验条件影响，并且表面积大幅增加，从而提高了检测灵敏度。同时，人字形结构产生了可控的微湍流，显著改善了流体混合效果并延长了目标蛋白与探针的接触时间。通过使用该平台分析来自膀胱癌外泌体的六种蛋白质生物标志物，我们证明了该平台在尿液外泌体检测中的高效高通量分析能力。因此，该平台展示了出色的诊断性能，为膀胱癌的早期检测和监测提供了一种有前景的方法。

引言

外泌体是细胞主动释放到细胞外环境中的纳米囊泡，携带反映其来源细胞膜的分子 cargo（Lone 等，2022；Tran 等，2021）。随着肿瘤的发展，肿瘤来源的外泌体数量会增加，而在临床缓解后则会减少（Hoshino 等，2020；Kalluri 和 LeBleu，2020）。因此，封装在肿瘤来源外泌体中的蛋白质生物标志物作为早期肿瘤检测和预后评估的非侵入性指标具有巨大潜力（Maas 等，2023；Tenchov 等，2022；Yu 等，2022）。然而，由于外泌体在生物流体中的含量较低，有效的富集和对其蛋白质 cargo 的敏感检测对于提取临床诊断信息至关重要（Kasiński 等，2025；Sun 等，2025）。尽管传统技术可以实现外泌体的分离或单目标检测，但缺乏同时进行富集和多重蛋白质分析的集成平台仍然是推进基于外泌体的诊断技术发展的关键障碍（Lone 等，2022；Yang 等，2022）。对于像膀胱癌这样的异质性疾病来说，这一限制尤为突出，因为单一生物标志物往往缺乏所需的灵敏度和特异性（Prip 等，2025）。因此，为了通过多重外泌体蛋白质分析捕捉互补的分子特征来构建稳健的诊断模型（Choi 等，2024），开发一种既能高效富集又能进行高通量多重分析的新生物检测系统对于膀胱癌诊断至关重要（Spitzberg 等，2023；Zhang 等，2024a；Zhang 等，2024b）。

在这里，我们提出了一种新的集成方法，利用微流控芯片与水凝胶条形码相结合，以实现高效的外泌体富集和多重生物标志物检测。微流控技术能够在微观尺度上精确操控流体，相比传统的固相微阵列芯片具有更优越的溶液动力学性能（Sun 等，2024；Ren 等，2024；Wang 等，2021）。值得注意的是，人字形微流控结构产生了可控的微湍流，显著提高了混合效率和反应动力学（Sun 等，2023；Ma 等，2023；Skubal 等，2025）。此外，光子晶体（PhC）条形码提供了稳定的结构颜色编码，不受实验条件影响（Hu 等，2024a；Hu 等，2024b；Wang 等，2023；Zhang 等，2022；Dadi 和 Ocsoy，2024）。当这些条形码与核心-壳层水凝胶结构结合时，非常适合用于液体活检应用，其扩大的表面积显著提高了检测灵敏度（Zheng 等，2024；Zhang 等，2024a；Zhang 等，2024b；Hu 等，2024a；Hu 等，2024b）。关键的是，将人字形混合器与这些编码微载体集成在单个微流控设备中，产生了协同效应。这种统一的方法解决了稀释样本中粒子-目标接触效率低以及从有限临床材料中进行多重、表面敏感检测的需求。

在这项研究中，我们通过将编码微载体与人字形微流控技术相结合，开发了一种高通量外泌体生物标志物检测系统（图 1）。利用光子晶体微粒作为模板，我们构建了核心-壳层编码微载体，与传统的固相表面相比，这些微载体对外泌体的富集能力更强。不同的生物探针被连接到不同颜色的条形码水凝胶表面，实现了外泌体的同时捕获和多重生物标志物的检测。人字形结构战略性地分布在微流控芯片的上表面，有效增加了流体阻力，产生了可控的微湍流，从而增强了生物反应界面并延长了相互作用时间。当这些水凝胶条形码集成到微流控系统中时，它们利用其独特的编码特性和稳定的结构颜色特征（不受实验条件影响），同时区分了多种外泌体蛋白质生物标志物。通过蛋白质组学分析鉴定膀胱癌外泌体的差异性生物标志物，并结合逻辑回归和接收者操作特征（ROC）曲线分析，我们证明了该平台具有出色的诊断性能。因此，这种集成方法在膀胱癌的临床诊断和监测中显示出巨大的潜力。

核心-壳层编码微载体的制备与表征

在典型的实验中，核心-壳层编码微载体是使用光子晶体微粒作为模板制备的，这些微粒由含有二氧化硅（SiO₂）纳米粒子的微流控液滴制成。这些 SiO₂ 纳米粒子液滴使用硅油作为连续相，单分散 SiO₂ 纳米粒子悬浮液作为分散相。在控制温度下蒸发溶剂后，SiO₂ 纳米粒子自组装成周期性有序结构。

材料

细胞培养基和补充剂，包括去外泌体的胎牛血清（FBS）、RPMI-1640、高糖 DMEM、含 NEAA 的 MEM、Ham's F-12K、胰蛋白酶-EDTA（0.25%）和青霉素-链霉素，均来自 Gibco（美国）。聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA，平均分子量 700）、聚乙二醇（PEG，平均分子量 400）、丙烯酸（AA）、光敏引发剂 2-羟基-2-甲基丙酮（HMPP）、聚二甲基硅氧烷（PDMS，Sylgard 184）、氢氟酸（HF，48%）和甲基硅油

结论

由于肿瘤的异质性以及高度敏感的非侵入性生物标志物的有限可用性，膀胱癌的诊断仍然具有挑战性。在这项工作中，我们开发并验证了一种高通量筛选系统，通过将光子晶体条形码微载体与人字形微流控芯片相结合来满足这一需求。该平台能够高效富集并多重检测尿液样本中的外泌体蛋白质。

CRediT 作者贡献声明

王静琳：方法学设计。朱叶飞：撰写、审稿与编辑、资金获取、概念构思。李宁：数据管理。方一乐：数据管理。魏小伟：撰写初稿、资金获取、正式分析、数据管理。蔡丽君：撰写、审稿与编辑

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本研究得到了江苏省自然科学基金（BK20220737）、中国博士后科学基金（2022M721404）、江苏省“333计划”高层次人才培育基金（BRA2018086）以及江苏省卫生健康委员会的医学研究项目（K2019020）的支持。