《Human Gene》：Unveiling acute inflammatory biomarkers in renal cell carcinoma (RCC): A proteomic approach
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肾细胞癌（RCC）患者血清中OPN、APOA1和TIMP4三种炎症介质显著升高（P<0.0001，AUC>0.96），通过LC-MS/MS和Luminex多联检技术验证可作为诊断生物标志物。
Safa Akhtar | Shahzadi Noreen | Farah Deeba | Saher Mahmood | Anna E. Lokshin | Muhammad Waheed Akhtar
旁遮普大学生物科学学院，巴基斯坦拉合尔 54590
摘要
与肿瘤相关的炎症介质在宿主对肿瘤的防御反应中起着至关重要的作用，它们通过促进肿瘤生长和逃避免疫反应来发挥作用。首次采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）和多重蛋白组学方法对来自巴基斯坦的肾细胞癌（RCC）患者的急性反应蛋白进行了分析。我们利用DAVID、GAD和富集的KEGG通路评估了炎症调节因子在RCC及邻近正常组织中的潜在作用。数据库显示，富集的KEGG通路与膀胱癌相关蛋白、转录失调、蛋白聚糖和癌症相关microRNA有关，这表明这些介质在肿瘤发生过程中可能具有潜在作用。通过多重珠子检测技术，我们量化了六种蛋白质在样本血清中的含量，包括肝细胞生长因子（HGF）、金属蛋白酶组织抑制剂-1（TIMP1）、TIMP4、载脂蛋白A1（APOA1）、铁蛋白（FR）和骨桥蛋白（OPN）。研究结果表明，OPN、APOA1和TIMP4在区分RCC患者和健康个体方面具有很高的潜力（P值<0.0001），ROC曲线下面积（AUC）>0.96。炎症蛋白的差异表达与肿瘤进展相关，可能作为RCC的潜在生物标志物。
引言
肾细胞癌（RCC）是一类起源于肾小管近端上皮细胞的肿瘤。它是全球第15大常见癌症，占所有成人恶性肿瘤的3%（Siegel等人，2017年；Clark和Zhang，2020年）。该疾病在北美、欧洲、印度、日本、中国和非洲的发病率较高（Clark和Zhang，2020年）。疾病的准确预后取决于癌症的转移阶段（Rijnders等人，2017年）。尽管在巴基斯坦的发病率较低（Medina-Rico等人，2018年），但每年仍有多例RCC病例被报告（Alaghehbandan等人，2022年）。通过比较肿瘤组织与正常组织或癌症患者血液中的蛋白质谱，可以更清晰地了解疾病的分子特征，这些特征通过体外研究难以直接观察到（Prieto等人，2014年）。
肿瘤发生的所有阶段，包括起始、促进、恶性转化、侵袭和转移，都涉及不同类型的炎症反应。即使是对个体免疫治疗的反应也受到炎症的影响（Schepisi等人，2019年）。只有少数癌症类型涉及种系突变，而所有其他风险因素和环境因素都是某些慢性炎症类型的促成因素（Singh等人，2019年）。炎症还可能影响肾脏功能，并通过复杂的分子事件导致细胞损伤（Chen和Busse，2017年）。多项研究表明，RCC是一种免疫原性癌症，免疫细胞和炎症通路在肿瘤进展和逃避免疫系统中起重要作用（Pastore等人，2015年）。
近年来，研究人员专注于各种蛋白组学和代谢组学方法，通过开发酶联免疫吸附测定（ELISA）和血清筛查来识别多种癌症（如结直肠癌、卵巢癌和肾细胞癌）的潜在生物标志物，每次验证一个生物标志物（Xu等人，2019年）。然而，通过在多重检测中同时筛查多种蛋白质（例如Luminex），可以提高对早期无症状人群的筛查特异性。Luminex结合了夹心免疫测定的基本原理和荧光珠技术，可以在仅12.5微升的样本中分析多达100种不同的分析物（Boylan等人，2017年）。在本研究中，利用LC-MS/MS分析，我们鉴定出15种急性反应炎症调节因子，包括肝细胞生长因子、铁蛋白、骨桥蛋白、载脂蛋白A1以及金属蛋白酶组织抑制剂1和4，这些因子在RCC组织样本中的表达与对照肿瘤邻近组织不同。通过使用Luminex技术进一步验证了这些急性反应炎症调节因子在巴基斯坦人群患者血清中的差异表达，发现LC-MS/MS和基于珠子的免疫测定在RCC组织和血清中对四种选定的炎症标志物（HGF、TIMP1、TIMP4和OPN）的定量结果存在不一致。这可能是由于使用了同一患者的肿瘤邻近组织作为对照组织；由于肿瘤-组织之间的相互作用，这些对照组织也可能富含炎症介质。然而，本研究中血清的多重分析显示，RCC患者中的这些炎症蛋白水平显著高于健康个体。此外，未来通过LC-MS/MS对该患者队列的肿瘤组织与健康肾细胞系进行比较研究，将有助于更好地理解这些分子的表达谱。
样本收集
在获得大学伦理审查委员会（参考编号873/12）的批准后，我们从巴基斯坦拉合尔的当地医院收集了术前被诊断为肾细胞癌（RCC）的患者以及年龄匹配的健康个体的血液样本（已获得知情同意）。纳入标准包括完整的临床病史，以及由合格病理学家评估的肿瘤分期为T2至T4的患者（表1）。
LC-MS/MS鉴定
六个肾细胞癌（RCC）样本和六个对照肿瘤邻近组织的裂解物接受了LC-MS/MS分析。所得数据文件使用特定搜索标准在Uniprot_Hum_Compl_20170714数据库中进行了搜索。蛋白质鉴定要求假发现率（FDR）≤1.0%，至少有2个独特的肽段，并且对于胰蛋白酶切割的肽段允许最多有2次切割遗漏。
讨论
肾细胞癌（RCC）是一组异质性肿瘤，如果在局部原发阶段和晚期阶段被诊断出来，其五年生存率分别为≤93%和≤12%（Hsieh等人，2017年）。早期诊断有可能降低RCC患者的死亡率并提高生存率。识别在RCC组织中与正常组织相比差异表达的蛋白质可以提供潜在的生物标志物，从而通过促进...
结论
我们的研究结果表明，OPN、APOA1和TIMP4能够有效区分RCC患者和健康个体（P值≤0.0001），ROC曲线下面积（AUC）>0.96，可能作为RCC筛查、诊断和治疗目标的潜在生物标志物。LC-MS/MS显示，肿瘤组织中炎症介质（HGF、TIMP1、TIMP4和OPN）的表达降低可能反映了疾病过程中肿瘤-邻近组织之间的广泛相互作用。
CRediT作者贡献声明
Safa Akhtar：撰写——原始草稿、方法学、正式分析、数据管理。Shahzadi Noreen：方法学、概念构思。Farah Deeba：撰写——审阅与编辑、方法学。Saher Mahmood：撰写——审阅与编辑、软件操作。Anna E. Lokshin：监督、资源协调、正式分析。Muhammad Waheed Akhtar：验证、监督、概念构思。
伦理声明
本研究获得了旁遮普大学伦理审查委员会的批准（决定编号873/12）。
资助
本工作得到了巴基斯坦高等教育委员会的支持，资助编号为2BM1-437。资助方未参与研究设计、数据收集与分析、发表决定或手稿的准备。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系，这些关系可能会影响本文所述的工作。
致谢
作者感谢巴基斯坦拉合尔当地医院的外科医生在样本收集方面提供的宝贵帮助。同时，他们也感谢巴基斯坦高等教育委员会提供的研究资助，以及韦恩州立大学提供的技术支持。
