橡胶树叶片作为天然橡胶生物质资源的探索：高含量品种的育种策略及水基橡胶提取方法

《Industrial Crops and Products》：Exploring rubber tree foliage as biomass for natural rubber: Breeding strategies for high-content cultivars and water-based rubber extraction

　　

天然橡胶（Natural Rubber, NR）的生产目前依赖于劳动密集型的割胶。本研究从橡胶树的落叶和鲜叶中探索橡胶生产，通过开发针对叶片橡胶含量优化的育种策略，并建立一种经济且环保的提取工艺。研究人员首次证明，橡胶树叶片含有与树皮来源的橡胶具有相似分子量（Molecular Weight, MW）和构象的NR。对四个商业无性系落叶的年橡胶产量估算范围为60.84至82.90 kg ha^?1——这一潜力可通过定向育种显著扩大。研究人员发现树皮与叶片橡胶含量之间无相关性，表明传统品种中高树皮橡胶产量并不能预示高叶片橡胶潜力。为解决这一问题，研究人员开发了一种叶柄胶乳测定法，用于对商业无性系和F1群体的叶片橡胶进行高通量筛选。初步筛选鉴定出一个基因型，其叶片橡胶含量比对照高79.3%，证明了选择高叶片橡胶品种的可行性。此外，研究人员开发了一种可规模化水基提取方法，基于鲜干重换算系数47.5%，粗橡胶提取率达到2.5%。该过程有望支持从专门为叶片橡胶生产培育的树木（例如矮化修剪树）进行周期性收获，为创新且可持续的橡胶生产系统铺平道路。

**论文解读文章**

**1. 研究背景与问题**

天然橡胶（Natural Rubber, NR）是一种独特的异戊二烯生物聚合物，即顺式-1,4-聚异戊二烯（cis-1,4-polyisoprene），广泛应用于制造超过50,000种产品，如汽车和飞机轮胎，具有战略重要性，且在多数关键应用中无法被合成替代品取代。全球NR消费量因工业发展持续增长，预计到2025年将达到19.10 Mt yr^?1，较2010年增长44%。当前，NR生产完全依赖于对成熟橡胶树树干树皮中乳管（laticifers）的割胶，但这一传统方法不仅劳动强度高，还存在严重健康风险（如蚊媒疾病），显著降低了其相对于合成橡胶的经济可行性。有趣的是，橡胶树叶片中也含有乳管，且具备机械化收割的独特优势。若叶片来源的橡胶质量与传统树干橡胶相当，则可成为可行的替代来源，减少劳动力需求并增强市场竞争力。然而，叶片橡胶在研究和工业应用中的利用仍基本未被探索。因此，本研究旨在系统调查叶片橡胶的特性、评估其产量潜力，并开发高效筛选方法以鉴定高叶片橡胶含量的无性系，为提升NR生产效率及建立新的橡胶树育种范式提供依据。

**2. 研究目的与意义**

本研究通过系统表征叶片橡胶的理化性质，评估其产量潜力，并开发了基于叶柄胶乳（petiolule latex）的高通量筛选方法，以鉴定高叶片橡胶含量的基因型。同时，建立了经济环保的水基提取工艺。研究意义在于：首次证实橡胶树叶片NR与树皮NR具有相似的分子量和构象；发现叶片橡胶与树皮橡胶产量无相关性，表明需针对叶片橡胶进行专门育种；开发的叶柄胶乳测定法可显著缩短育种周期；提出的水基提取方法可规模化应用，为建立可持续的叶片橡胶生产系统奠定基础，有望补充传统割胶橡胶供应。该论文发表在《Industrial Crops and Products》。

**3. 主要关键技术与方法**

研究人员主要采用了以下关键技术方法：（1）索氏提取法（Soxhlet extraction）测定叶片橡胶含量，先以丙酮去除杂质，再以环己烷提取橡胶；（2）凝胶渗透色谱法（Gel Permeation Chromatography, GPC）分析橡胶分子量（MW）及分布；（3）动态光散射法（Dynamic Light Scattering, DLS）分析橡胶粒子（Rubber Particles, RPs）的尺寸分布；（4）核磁共振波谱法（Nuclear Magnetic Resonance, NMR）分析橡胶的碳链构象；（5）叶柄胶乳测定法（petiolule latex method）用于高通量筛选叶片橡胶含量，通过测量叶柄切口处渗出胶乳的干重与对应叶片干重的比值来评估；（6）稳定化水基提取法（stabilized water-based extraction method）提取叶片粗橡胶，优化了缓冲液组成、料液比、提取次数、时间、搅拌速度和温度等参数。样本来源包括位于中国海南省儋州的中国热带农业科学院（CATAS）试验农场以及保亭热带作物研究所试验农场的橡胶树无性系和F1群体。

**4. 研究结果**

**4.1 橡胶树叶片橡胶含量的动态变化**
研究人员在橡胶树叶片中鉴定出六个发育阶段：古铜期、变色期、淡绿期、成熟期、褪色期和落叶期。通过索氏提取法测定橡胶含量，发现单位叶面积橡胶含量（56.89–62.16 μg cm^?2）在所有发育阶段保持统计学一致，而单位叶重橡胶含量在成熟期显著降低至0.89%（其他阶段为1.19–1.39%），这是由于成熟叶片干物质增加导致的稀释效应，并非橡胶降解。总橡胶含量在叶片扩展至淡绿期后稳定在5.63 mg/叶，直至落叶期无显著变化，表明橡胶生物合成在叶片扩展完成后停止，且不降解。

**4.2 叶片橡胶粒子与橡胶分子的特性**
通过动态光散射（DLS）分析，叶片与树皮胶乳中橡胶粒子（RPs）的数量分布相似，平均直径分别为277.4 nm和279.2 nm，小粒子（<500 nm）占绝大多数（94.0% vs 93.1%）。但体积分布差异显著：叶片RPs呈单峰分布（平均453 nm），而树皮RPs呈双峰分布，其中超大型RPs（>1200 nm）虽数量稀少但占总体积的71.1%。凝胶渗透色谱（GPC）分析显示，叶片橡胶的数均分子量（Mn）和重均分子量（Mw）分别为1.39×10⁵ g mol^?1和5.06×10⁵ g mol^?1，与树皮橡胶（1.49×10⁵和5.47×10⁵ g mol^?1）相当，且多分散性指数（3.64 vs 3.67）高度相似。但叶片橡胶的MW分布为单峰（峰值6.18×10⁵ g mol^?1），树皮橡胶为双峰，且叶片橡胶的分子量范围更窄（3.85–7.04×10⁵ vs 3.81–7.22×10⁵ g mol^?1），表明更高的均匀性。核磁共振（NMR）分析（¹H和¹³C NMR）证实叶片橡胶与树皮橡胶均为顺式-1,4-聚异戊二烯，化学位移完全一致。

**4.3 已建植橡胶园的落叶橡胶生产潜力**
对四个商业无性系（Reyan 7-33-97、Reyan 8-79、RRIM 600和PR 107）的落叶生物量进行为期一年的监测，发现落叶集中在2月至4月，占总落叶量的65.5–71.2%。年落叶干生物量范围为5.18–6.43 t ha^?1，其中Reyan 7-33-97最高。基于叶片橡胶含量，估算的年落叶橡胶产量为60.84–82.90 kg ha^?1，相当于树皮橡胶产量的4.18–6.80%。

**4.4 叶片橡胶含量与树皮产量无相关性**
对8个代表性无性系的叶片橡胶含量和树皮橡胶产量进行相关性分析，发现两者无显著相关性（r = 0.1876, R2 = 0.0352, p > 0.05）。例如，叶片橡胶含量最高的无性系93-114（1.76%）却是树皮橡胶产量最低的品种之一。这表明传统以树皮橡胶为目标的育种并未选择高叶片橡胶性状。

**4.5 叶片橡胶含量与叶柄胶乳值呈正相关**
研究人员测量了8个无性系的叶柄胶乳值（petiolule latex value），发现其与树皮橡胶产量无相关性，但与叶片橡胶含量呈强正相关（r = 0.908, R2 = 0.8237, p < 0.01）。因此，叶柄胶乳值可作为预测叶片橡胶含量的可靠指标。

**4.6 通过叶柄胶乳法筛选F1群体中的高叶片橡胶无性系**
应用叶柄胶乳法对来自IAN 873 × Reken 106杂交的24个随机F1个体进行筛选，叶柄胶乳值范围为6.60–26.44 mg g^?1。进一步验证发现，叶片橡胶含量与叶柄胶乳值呈强正相关（r = 0.857, R2 = 0.7346, p < 0.01）。其中，个体7-13的叶片橡胶含量高达2.31%，比对照商业无性系Reyan 7-33-97（1.29%）高79.3%，证明了该筛选方法的有效性。

**4.7 利用稳定化水基提取法提取叶片橡胶**
研究人员通过系统优化，建立了稳定化水基提取工艺。最佳条件为：4倍体积提取缓冲液（0.1% Na₂SO₃、0.2% NH₄OH、0.1%酪蛋白），150 rpm搅拌，50°C提取30 min，两次提取。从50 g鲜叶中获得0.6 g粗橡胶，基于鲜干重换算系数47.5%，粗橡胶提取率为2.5%（相对于干叶质量）。¹H NMR分析确认提取物主要为顺式-1,4-聚异戊二烯，但含有树脂、蛋白质和碳水化合物等杂质，可通过进一步纯化去除。

**5. 讨论与结论**

**讨论部分总结**：研究人员讨论了叶片橡胶含量的动态变化，指出橡胶生物合成在叶片扩展完成后终止，且作为终产物保持稳定，不降解。叶片与树皮橡胶的分子量分布差异归因于其不同的乳管系统起源（初生乳管 vs 次生乳管），但平均分子量相似，表明叶片橡胶具有相似的物理机械性能。落叶橡胶作为补充资源年产量可达60.84–82.90 kg ha^?1，占中国橡胶总产量的理论潜力为7.03–9.58%，且无需额外土地。叶柄胶乳法的正相关性源于初生乳管与次生乳管不同的遗传调控机制，为快速筛选高叶片橡胶品种提供了高效工具。水基提取法具有环保、可规模化的优势，有望结合矮化灌木型栽培模式（shrubby cultivation），实现机械化收割，缩短等待期，增强气候适应能力，革新NR生产体系。

**研究结论部分翻译**：从橡胶树叶片中提取的橡胶表现出与树皮橡胶相似的构象和平均分子量（MW），且分子量分布更均匀。值得注意的是，从淡绿期到叶片衰老（包括落叶）期间，每片叶的总橡胶含量保持稳定。基于对中国四个已开发品种总落叶干生物量5.18–6.43 t ha^?1的估算，年落叶橡胶生产潜力为60.84–82.90 kg ha^?1，占其树皮橡胶产量的4.18–6.80%。这些发现突显了落叶在天然橡胶（NR）工业中尚未开发的巨大潜力。为实现叶片橡胶的商业化，必须开发具有高叶片橡胶含量的品种以及成本效益高且环保的提取方法。当前育种计划主要针对树皮橡胶生产，但研究揭示叶片橡胶含量与树皮橡胶产量无相关性，表明高树皮产量的品种不一定适合叶片橡胶生产。研究人员进一步在商业无性系和F1群体（IAN 873 × Reken 106）中鉴定出叶柄胶乳性状与叶片橡胶含量之间存在强相关性。基于此，研究人员开发了一种高效的叶柄胶乳筛选方法，以鉴定高叶片橡胶含量的基因型。在初步试验中，仅筛选24个随机植株，就鉴定出一个叶片橡胶含量为2.31%的个体，比商业品种Reyan 7-33-97高79.3%。这表明大规模筛选可轻松发现具有优异叶片橡胶生产力的品种。此外，研究人员建立了一种可规模化的水基提取工艺，从50 g鲜叶中回收0.6 g粗橡胶，基于鲜干重换算系数47.5%，粗橡胶提取率为2.5%。这些发现对橡胶树育种和栽培系统具有变革性意义。专业化高叶片橡胶品种的开发，结合快速筛选方法和环保橡胶提取工艺，可通过使叶片收割成为传统割胶的商业可行补充，彻底改变NR生产。