《Protein Expression and Purification》：A novel flavin-containing monooxygenase from
Pseudomonas guineae enables efficient biosynthesis of indigo from indole via both enzymatic and cell factory approaches
编辑推荐：
产靛蓝酶FMO的筛选与特性研究：从七株菌中筛选出Pseudomonas guineae的PgFMO，经纯化证实其具有双吸收峰（360nm和442nm），最适pH8.0和20℃条件，动力学参数显示Km=2.5mM，kcat=0.027s-1。通过代谢工程改造的大肠杆菌BL21(DE3)摇瓶培养获得260mg/L靛蓝产量，其性能接近已广泛研究的MaFMO。
Zhebin Hao|Yulei Zhang|Wenli Zhang|Yingying Zhu|Wanmeng Mu
江南大学食品科学与工程学院食品科学与资源国家重点实验室，中国无锡，214122
摘要
靛蓝是一种重要的蓝色色素，广泛应用于纺织、食品和制药行业。目前，大部分靛蓝是通过化学合成方法生产的，这导致了环境污染和对消费者的潜在健康危害。因此，靛蓝的生物合成方法越来越受到关注。含黄素的单加氧酶（FMO）是从吲哚生产靛蓝的重要酶，然而，目前已仅鉴定出五种能够生成靛蓝的FMO。在这项研究中，我们从七种候选菌中成功筛选出一种来自Pseudomonas guineae的新型靛蓝生成FMO。我们对这种重组酶进行了全面的表达、纯化和鉴定研究。纯化的酶在360纳米和442纳米处有两个吸收峰，表明其结合了辅因子。该酶在pH 8.0和20°C时表现出最高的活性。其Km、Vmax、kcat和kcat/Km值分别为2.5 mM、2.9 × 10-3 mM/min、0.027 s-1和0.011 mM-1 s-1。通过代谢工程改造的E. coli BL21(DE3)菌株，评估了P. guineae FMO的in vivo靛蓝生成能力。在删除竞争基因、增强色氨酸生物合成途径并优化吲哚运输后，通过摇瓶培养成功获得了260 mg/L的靛蓝产量。
引言
靛蓝是一种经典的蓝色色素，广泛应用于纺织、食品和医药等工业领域。数千年前，人类就已经掌握了使用植物靛蓝进行染色的技术。100多年前，Baeyer和Emmerling开发了靛蓝的化学合成方法。如今，化学合成的靛蓝已经取代了植物提取的靛蓝，成为工业生产的主流，全球靛蓝年产量约为8万吨。然而，化学合成靛蓝需要使用石油基原料和一些有毒化学试剂，这对环境造成不可持续的破坏，并可能危及从业者和消费者的健康[1]、[3]。作为一种可持续且环保的生产方法，通过酶或微生物途径进行靛蓝的生物合成在工业界备受期待[1]。40多年前，Ensley等人发现携带Pseudomonas putida萘双加氧酶（NDO）的重组Escherichia coli可以在微生物生长过程中生成靛蓝[2]。研究表明，内源性色氨酸酶（TnaA）可以将色氨酸水解为吲哚，而异源的NDO可以催化吲哚羟基化为吲哚酚，后者在空气介导的氧化作用下自发二聚化为靛蓝（图1A）[2]。随后，发现超过10种不同的氧化还原酶能够将吲哚转化为靛蓝，其中含黄素的单加氧酶（FMO）是研究最广泛的靛蓝生成酶[3]。
2003年，Choi等人研究了Methylophaga aminisulfidivorans FMO（简称MaFMO）的表达、纯化和鉴定，这是首次报道的靛蓝生成FMO[4]。随后，Singh等人从污水处理厂污泥的宏基因组文库中筛选出两种能够将吲哚转化为靛蓝和靛红混合物的黄素单加氧酶，包括一种FMO（metaFMO）和一种Baeyer-Villiger单加氧酶（metaBVMO）[5]。此外，还从Corynebacterium glutamicum（CgFMO）[6]、Nitrincola lacisaponensis（NlFMO）[7]和Polygonum tinctorium（PtFMO）[8]中分别鉴定出三种其他细菌产生的靛蓝FMO。MaFMO常被用于通过微生物代谢工程生产靛蓝[9]。TnaA和FMO的共表达在五种FMO中显示出最高的in vivo靛蓝生成能力[10]。通过多种代谢调控策略增强了基于MaFMO的工程菌株的靛蓝产量。Pham等人利用MaFMO作为限速酶，在E. coli中构建了从头合成靛蓝的自动诱导途径[11]。Hu等人通过降低吲哚的毒性来提高靛蓝产量[12]。
许多研究集中在通过代谢工程改造的菌株进行靛蓝的微生物合成上，但产量仍不足以实现工业化生产。FMO的酶促合成是另一种生物方法，但酶促转化依赖于NADPH，需要NADPH的再生才能进行下一轮反应[3]、[4]、[13]、[14]。Rioz-Martínez等人将MaFMO与Pseudomonas stutzeri的亚磷酸脱氢酶（PsPTDH）融合，设计出一种自给自足的双功能酶用于靛蓝生产。PsPTDH可以通过催化低成本底物亚磷酸盐氧化为磷酸盐来再生NADPH[13]、[14]。最近，通过定向进化结合基于颜色的高通量筛选，成功筛选出一种单点突变体D197E，其催化效率和比活性分别提高了1.34倍和2.36倍[15]。
在这项研究中，我们尝试从七种候选菌中筛选出一种新型靛蓝生成FMO。当将Pseudomonas guineae FMO（PgFMO）引入E. coli BL21(DE3)后，重组细胞的培养液呈现蓝色，表明其具有靛蓝生成能力。随后通过一步镍亲和层析纯化了PgFMO，并对其酶学性质和动力学进行了研究。进一步证明该酶能够在in vivo条件下通过代谢工程改造的E. coli生成靛蓝。
重组大肠杆菌菌株的构建
来自不同来源的七种FMO的编码基因被融合到一个带有6个组氨酸标签的载体上，并分别插入pET-22b(+)载体的T7启动子之后：P. guineae（PgFMO，GenBank登录号WP_090242441.1）、Aquamicrobium lusatiense（AlFMO，WP_183832162.1）、Mesorhizobium ciceri bv. biserrulae（McFMO，WP_013532892.1）、Lampropedia hyaline（LhFMO，SHE40426.1）、Leptothrix cholodnii（LcFMO，WP_012345191.1）、Cypionkella aquatica（CaFMO，GLS88238.1）和Rhizobium setariae
新型微生物FMO的筛选用于靛蓝生物合成
如上所述，目前已报道的能够生成靛蓝的FMO仅有五种，包括MaFMO [4]、metaFMO [5]、CgFMO [6]、NlFMO [7] 和 PtFMO [8]，其GenBank登录号分别为AAM18566.2、ADE73875.1、SJM62727.1、AZU96663.1和BCL56286.2。通常，E. coli本身含有内源性TnaA，可以从内源性合成或外源补充的色氨酸生成吲哚，因此简单地引入靛蓝生成FMO的重组E. coli很容易产生蓝色
结论
在这项研究中，我们成功筛选并鉴定出一种来自Pseudomonas guineae的新型靛蓝生成FMO，并对其in vitro和in vivo的靛蓝生成能力进行了评估。其靛蓝产量与研究最深入的MaFMO相当，甚至高于其他几种已报道的FMO，显示出其在生物靛蓝生产方面的潜力。然而，其目前的靛蓝合成能力仍不足以满足工业化需求。未来，可以通过蛋白质工程进一步改进其性能
CRediT作者贡献声明
Zhebin Hao：撰写——原始稿件、实验设计、数据分析。Yulei Zhang：撰写——审稿与编辑、数据分析。Wenli Zhang：撰写——审稿与编辑、数据分析。Yingying Zhu：数据分析、数据管理。Wanmeng Mu：项目监督、管理及概念构思
数据获取
数据可应要求提供。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。
致谢
本工作得到了中央高校的基础研究基金（编号JUSRP622008）的资助。
