本文研究了一种基于三元低共熔溶剂（DES）体系（由氯化胆碱、乙二酸和乙二醇组成）对木质纤维素生物质进行高效分馏并分离出具有不同结构特征和乙二醇修饰水平的木质素的新方法。通过优化条件进行桦木的反应分馏，获得了高木质素产率（66%），并保留了高达75%的β-O-4芳基醚键。系统的温度、时间和DES组成变化表明，乙二醇的掺入与温度和时间相关，在140-160°C和短反应时间下观察到最佳的结构保护。所得的乙二醇修饰木质素成功应用于通过水溶助长和pH诱导闪蒸沉淀法可控合成木质素纳米颗粒（LNPs）。后者可获得尺寸可调、胶体稳定性好、表面电荷适宜的LNPs，凸显了其在材料应用方面的潜力。
中文标题：三元低共熔溶剂反应分馏：乙二醇修饰木质素的精准制备与纳米颗粒形成研究
《ACS Sustainable Chemistry & Engineering》：Alcohol-Decorated Lignins for Nanoparticle Formation through Reactive Fractionation in Ternary Deep Eutectic Solvent Systems
1. 引言
木质素是一种天然丰富的生物聚合物，具有作为可持续可再生资源用于制造多种化学品和材料的巨大潜力。特别是利用其固有的刚性聚合物性质和模块化结构，木质素在制备具有定制性能和功能的宝贵材料方面前景广阔。木质素纳米颗粒（LNPs）是将木质素潜力应用于环境和生物医学等多个领域的通用工具。开发能够实现高木质素回收率、高纯度且具有合适结构特征的新型分馏策略至关重要。
深共晶溶剂（DESs）已成为生物质分馏策略的强大替代方案。由于其良好的物理化学性质、易于制备和可调组成，DESs为生物精炼中通常使用的经典有机溶剂提供了一种有前景的替代品。常见的基于DES的策略包括选择性木质素溶解、碱性DES预处理以破坏木质素-碳水化合物复合物并增加生物质孔隙率，以及仔细调整DES组成和工艺条件以优化分馏效率。
先前的研究开创性地使用由氯化胆碱（ChCl）、乙二酸（OA）和乙二醇（EG）组成的组成可调的三元DES系统对木质纤维素进行温和分馏，同时获得高质量的木质素和纤维素。研究发现，添加EG作为DES组分可以抑制不希望的再缩合现象。具体而言，将EG作为氢键供体（HBD）组分包含到三元DES中，抑制了再缩合木质素在纤维素残渣上的沉积，从而在生物催化处理后获得优异的葡萄糖产率。此外，如此获得的木质素在β-O-4部分的苄位引入了乙二醇，导致这些键的高度保留和显著更低的再缩合。重要的是，乙二醇的掺入保留了羟基官能团，为进一步的化学修饰、交联或接枝反应提供了可接近的反应位点。最后，研究表明该DES系统可以多次回收，对木质素产率和质量影响极小，突显了其具有成本效益和可扩展应用的潜力。
鉴于先前研究的三元DES系统（包含ChCl/OA/EG）缺乏深入研究，本工作旨在了解分馏条件的系统变化如何影响分离木质素的结构，特别关注β-O-4键的保留和EG掺入。通过改变关键参数，评估了分离木质素的β-O-4含量和EG掺入程度、缩合程度、分子量和多分散性。
2. 方法
2.1. 生物质制备
通常，将桦木、松木、核桃壳和小麦秸秆研磨，然后过筛收集粒径在355–500 μm范围内的生物质颗粒。甘蔗渣仅进行粉碎而未过筛。所有获得的生物质均使用索氏提取器用甲苯/乙醇（2/1，v/v）脱蜡8小时。去除溶剂后，将处理过的生物质在70°C下进一步干燥16小时，并在使用前保存在密封袋中。
2.2. DES制备
DES按照先前出版物中的方法制备。通常，将预定量的ChCl和EG混合在250 mL圆底烧瓶中剧烈搅拌30分钟。随后加入预定量的OA，将混合物加热至用于木质素分馏的温度，直至形成透明液体。
2.3. 通过DES进行木质纤维素分馏的示例程序
木质纤维素分馏在250 mL圆底烧瓶中进行。通常，将3.12 g OA添加到由16.8 g ChCl和14.4 g EG组成的预混合液体混合物中，在特定温度下加热并搅拌直至形成透明液体。然后通过玻璃漏斗将4 g生物质添加到混合物中。将混合物加热并在预定温度下搅拌（步骤1）。达到预定保留时间后，用冰浴冷却烧瓶。冷却后，向混合物中加入200 mL 90%（v/v）乙醇并搅拌2小时（步骤2）。所得混合物用配有单层滤纸的玻璃坩埚过滤。获得的固体进一步用90%乙醇洗涤，在70°C下干燥16小时，最后称重。收集液相，并在40°C和50 mbar下通过旋转蒸发器浓缩至干。将获得的油滴加到500 mL Milli-Q水中以促进木质素沉淀（步骤3）。通过以6000 rpm离心10分钟回收沉淀的木质素，并用Milli-Q水洗涤两次。获得的木质素通过冷冻干燥24小时干燥，得到指定为回收固体的粉末，并进一步分析。
接下来，水相用四氢呋喃（THF）进一步萃取（步骤4）。首先用水饱和氯化钠饱和，并用3 × 100 mL THF萃取该相。合并THF相并用无水硫酸镁干燥。通过真空旋转蒸发器去除THF，得到深色油状物作为最终产物。
2.4. 通过水溶助长法合成LNPs（DES_LNPs）
通过水溶助长法（DES_LNPs）合成木质素纳米颗粒涉及将木质素溶解在对甲苯磺酸钠水溶助长剂溶液中，然后通过水稀释进行纳米沉淀。最初，将0.21 g木质素加入10 mL 2 M对甲苯磺酸钠水溶液中并搅拌12小时，最终浓度为21 g/L。随后使用0.45 μm注射器过滤器过滤溶液以去除杂质。然后用水以1:3的比例稀释，使最终对甲苯磺酸钠浓度达到0.5 M。将悬浮液以6000 rpm离心15分钟，每次离心后，固体都用水彻底洗涤以完全去除残留的对甲苯磺酸钠。在此过程中丢弃上清液。
该合成方案应用于在不同条件下提取的DES提取木质素：120°C处理2小时和4小时，以及80°C处理24小时。相同的方案也应用于通过二恶烷/HCl酸解提取的磨木木质素（MWL）作为基准。
2.5. 通过pH骤降诱导闪蒸沉淀法合成LNPs（DES_FP_LNPs）
在标准合成程序中，将125 mg木质素溶解在25 mL乙二醇中。将溶液涡旋30分钟，通过0.45 μm注射器过滤器过滤，并放入闪烁瓶中。通过将2 mL 0.025 M硝酸溶液快速引入连续搅拌的5 mL乙二醇-木质素溶液中，实现pH骤降诱导闪蒸沉淀木质素纳米颗粒（DES_FP_LNPs）的形成。然后用水稀释溶液以停止颗粒生长，直至最终乙二醇浓度达到10%。使用动态光散射（DLS）和ζ电位测量对所有所得颗粒进行表征。
2.6. 木质素表征
2.6.1. 分子量测量
测量前，所有木质素样品均通过略微修改已发表的方法进行乙酰化。对于乙酰化，将2 mg木质素称量到4 mL小瓶中，然后加入100 μL吡啶和100 μL乙酸酐。将混合物在室温下避光搅拌16小时，并通过吹气去除溶剂。将干燥的木质素溶解在1 mL四氢呋喃（THF）中，并在测量分子量（MW）前通过0.22 μm PTFE过滤器过滤。通过凝胶渗透色谱法（GPC）测量MW和分布。
2.6.2. 二维异核单量子相干谱（2D HSQC NMR）
使用配备直接探头的300 MHz仪器收集2D HSQC NMR光谱，并使用"hsqcetgpsi2"脉冲序列进行13C–1H相关实验。使用报告参数进行轻微修改进行分析：光谱在F2（1H）中使用从8到0 ppm的2050个数据点（采集时间199 ms），在F1（13C）中使用从160到0 ppm的32次扫描，内部延迟为1秒。总采集时间为2.3小时。使用DMSO溶剂的信号作为内参。通过MestReNova软件对HSQC光谱中的等高线进行体积积分，并根据报告公式基于S、G和H信号的总积分用于相对半定量。
2.6.3. 通过GC–MS分析单体产物
将THF萃取合并水相获得的粗生物油溶解在甲醇中，得到浓度为5 mg/mL的溶液，适合进行GC测量。通过0.45 μm PTFE过滤器后，将样品注入配备HP1-MS毛细管柱的GC–MS中。使用已发表工作中的以下方法进行测定：进样口温度280°C，柱温程序：60°C保持2分钟，以10 K/min的升温速率升至310°C，检测器温度320°C。
2.6.4. LNPs的物理化学表征
使用配备633 nm激光作为光源的Malvern Z-sizer Ultra仪器获得DLS和ζ电位测量数据。为确保测量准确，样品需要稀释至最低浓度23 mg/L。在纳米颗粒形成后，所有样品最初分散在浓缩水溶液中。对于DLS分析，使用的水溶液进一步稀释至1 mg/mL。
3. 结果与讨论
3.1. 工艺参数对桦木木质纤维素在三元DES中分馏的影响
使用新开发的生物质分馏和木质素回收程序，研究了工艺参数对木质素产率和结构的影响。首先，在80°C的低温下，使用ChCl/EG/OA的DES组成在不同时间间隔（2、6、12、24和72小时）系统地评估了木质素分馏。虽然在此类温和条件下进行生物质分馏通常效率很低，但在本研究中，分馏在低至80°C的温度下进行24小时即可发生，尽管木质素回收产率较低（<10%），但木质素分子量较高（4600 Da）。此外，观察到芳基醚部分（常规β-O-4(OH)和修饰的β-O-4(OEG)的组合）含量较高。
接下来，为了提升分馏效率和木质素回收产率，进行了一系列系统实验，在保持相同ChCl/EG/OA DES组成通常2小时的情况下，逐步将处理温度从100°C提高到200°C，每次提高20°C。有趣的是，观察到木质素产率从100°C时的5.5%几乎线性增加到180°C时的65.4%，同时起始桦木的质量损失从17.5%逐渐增加到45.5%，表明温度在提高木质素产率方面起着重要作用。质量损失值表明，在较低温度下，脱木质素不完全，而在较高温度下，由于该DES系统的酸性，半纤维素也发生降解。虽然在200°C下获得了高木质素产率，但即使在反应1小时后也观察到显著的结构改变。
通过半定量2D HSQC NMR光谱分析回收的木质素（E8–E15），以了解结构修饰，包括各种连接基序的分布，以及EG掺入程度随温度的变化。β-O-4键的总含量（TA）从80°C时的49.8/100 C9逐渐降低到100°C时的44.2/100 C9，然后到200°C时的17.5/100 C9；然而值得注意的是，即使在200°C下，仍观察到相对较好的β-O-4部分保留。为了表达EG掺入程度，描绘了带有和不带有苄基取代的β-O-4连接基序之间的比率。该值随分馏温度升高而增加，在140°C时达到4.5（E12），在160°C时达到4.6（E13），而在180°C时降至3.8（E14），在200°C时降至3.2（E15）。这些实验表明，EG掺入的最佳温度范围是140–160°C。此外，随着温度升高，观察到芳香单元的缩合逐渐增加，在200°C时达到28.2/100 C9。相应地，S/G比率从2.6（E8）增加到4.2（E15）。
接下来，系统研究了分馏时间的影响，在120°C下进行2、4、6和12小时，以及在140°C下进行2、6和12小时。总体而言，令人惊讶的是，延长分馏时间并未显著影响回收的木质素产率。然而，长时间的DES处理导致EG掺入逐渐显著增加和轻微的结构改变，这通过改变的S/G比率和分子量降低得到证明。值得欣慰的是，在这些反应温度下，即使分馏时间延长，也没有明显的缩合，这归因于EG掺入的保护作用。
3.2. DES组分的影响
研究的三元DES将ChCl作为氢键受体（HBA）与作为氢键供体（HBD）的乙二酸（OA）和乙二醇（EG）结合，在分馏过程中扮演不同的关键角色。先前已确定乙二酸能有效促进木质素从细胞壁中释放，从而促进木质纤维素分馏。然而，酸性条件下的制浆会通过酸介导的仲醇脱水影响β-O-4部分，随后形成相对稳定的苄基碳正离子，这些碳正离子易于发生再缩合反应和/或进一步断裂。如前所述，EG的有益作用是抑制这些不希望的再缩合反应，维持β-O-4部分，并最终产生具有更高抗降解稳定性的EG修饰木质素。如此获得的木质素显示出与典型有机溶剂木质素不同的性质。
为了研究DES组分的影响，制备并测试了四种不同的DES组成和2种OA/EG混合物。当仅使用由ChCl和OA制备的DES组成在120°C下处理4小时时，获得的木质素显示出较少的β-O-4键和较低的分子量（1200 Da），表明DES中的EG对于保护木质素结构完整性起着关键作用。没有EG稳定化，木质素会发生缩合和部分解聚。
接下来，通过使用ChCl/EG/OA（摩尔比1:2，10 wt%）与ChCl/EG/OA（摩尔比1:4，10 wt%）进行实验，研究了EG负载量的变化。增加EG负载量将EG掺入比率从3.8提高到5.1。这也清楚地体现在所获木质素的分子量上。将OA负载量从10%增加到20%显著提高了木质素产率。然而，观察到芳基醚键的损失和缩合增加，这与反应介质较高的酸度一致。木质素中的β-O-4芳基醚键已知对酸敏感。因此，增加OA负载量导致生物质中更高的木质素释放，但同时导致β-O-4键降解，从而降低结构保存。比较质量损失时，预期较高酸度下碳水化合物部分的降解也更加显著。
为了进一步确认原始三元DES系统的作用，分别在120°C和100°C下，在不使用ChCl的情况下进行了两次单独的分馏，分别处理4小时和12小时。在这些情况下，分馏在EG作为溶剂中进行，酸度由OA的量控制。正如预期，在没有真正DES溶剂的情况下，木质素回收产率在120°C时保持较低水平。进一步增加OA负载量并将分馏时间延长至100°C下12小时，将木质素产率提高至20.1%。这些数据进一步表明OA促进了木质素从生物质中的释放。有趣的是，在EG作为溶剂中获得的木质素根据反应条件显示出明显不同的分子量值。这可能为使用该溶剂分离具有不同分子量的木质素开辟了可能性。
此外，还研究了生物质颗粒尺寸对分馏效率的影响。为此，按照先前报告的方案对桦木进行球磨，并通过筛分收集不同尺寸范围的桦木木质纤维素。结果表明，球磨对木质素回收产率有积极影响。
最后，还评估了在生物质分馏前向DES中受控添加水（高达10%）的效果。有趣的是，增加DES水含量也对木质素回收产率有积极影响，这可能是由于从细胞壁中更有效地去除了半纤维素衍生的糖。
3.3. 将DES提取扩展到各种木质纤维素物种
木质纤维素生物质根据植物种类、地理位置和环境因素表现出广泛的组成和结构变化。因此，评估了DES分馏方法在各种木质纤维素来源中的应用。除了桦木，还选择了其他生物质，包括松木、小麦、核桃壳和甘蔗渣，分别代表软木、草本和生物质残渣。所有分馏均在140°C下进行2小时，这是早期为桦木木质纤维素确定的获得良好木质素回收产率和高β-O-4保留的最佳条件。总体而言，不同的生物质显示出明显不同的木质素产率，这符合预期，因为它们具有不同的木质素含量。在相同条件下，从小麦秸秆中分离的木质素产率最高（44.8%），远远超过从松木中获得的产率（21.0%）。此外，还从其他生物质如核桃壳和甘蔗渣中分离了木质素。
就芳基醚键而言，在相同的DES分馏下，核桃壳木质素仍含有36.9/100 C9的β-O-4含量，高于桦木的25.0/100 C9。松木木质素的β-O-4含量略高于甘蔗渣获得的木质素。然而，最高的EG掺入水平（7.4%）出现在松木木质素中。这一趋势也通过分子量、EG掺入和缩合程度得到突显，这可能是由于S、G和H单元的比例不同，这些比例与芳基醚键的稳定性和苄基羟基的反应性密切相关。例如，富含紫丁香基（S）单元的硬木（如核桃壳和桦木）通常显示出更高的β-O-4保存率，而富含愈创木基（G）的软木（如松木）缩合程度更高，因此产出的木质素量较少，完整的β-O-4键也较少。草类（如小麦秸秆和甘蔗渣）显示出额外的羟基肉桂酸衍生的单元，这些单元影响溶解效率和键稳定性。这些差异凸显了需要通过这种DES对木质素分馏进行进一步深入优化，以最大化不同木质纤维素中木质素的分离和有价值键的保存。
3.4. 从水相获得的残余有机提取物分析
最后，研究了分馏和木质素沉淀后残留在水相中的残余木质纤维素衍生产物。木质素回收程序包括将浓缩的木质素液滴加到水中，通过过滤回收高纯度的目标木质素。为了了解残留的水溶性产物的性质，使用THF萃取了一系列分馏实验的水相，然后在去除THF后进行2D HSQC NMR、GPC以及GC–MS分析。
正如预期，水相含有水溶性物质，范围包括半纤维素、糖衍生物、芳香族单体、EG功能化的木质素低聚物片段，甚至高度缩合的木质素片段，具体取决于分馏温度。分馏过程中产生的低分子量木质素片段由于酚羟基含量较高和乙二醇掺入而极性增加，从而增强了它们在DES淬灭和洗涤步骤中在水中的溶解度。有趣的是，在较温和条件（80–100°C）下的DES分馏使得半纤维素及其衍生物几乎选择性萃取到水相中，这也通过高分子量以及2D HSQC NMR中存在碳水化合物相关信号和缺乏芳香信号得到证实。相比之下，从120°C以上的分馏中观察到典型的归因于木质素及其衍生低聚物的芳香信号，其结构差异显著取决于处理条件。例如，在约120°C时，观察到更明显的EG掺入，而在200°C以上时，观察到显著的缩合。
对THF提取物的挥发性单体范围的详细GC–MS分析揭示了单酚化合物的微弱信号，这些信号与通过酸解和二醇辅助分馏进行的木质素解聚一致，以及源自（半）纤维素在EG存在下降解的信号。这些表明，特别是在较高的分馏温度下，除了主要的二醇介导的EG保护木质素途径外，酸介导的木质素碎裂也是所用三元DES系统中的可行途径。这些芳香族单体在木质素分离过程中不会与木质素共沉淀，而是保留在水相中。
总体而言，可以得出结论，本文开发的分馏和木质素沉淀/纯化方案在优化条件下以高纯度和良好产率生产出明确的木质素；然而，一些材料损失到水相中，特别是通过EG掺入或碎裂，无法完全避免。
3.5. 由ChCl/EG/OA提取分离的木质素形成的胶体分散体
最近木质素高值化的趋势指向生产LNPs的胶体分散体，作为纳米复合材料可能的高附加值组分。为了将DES提取的木质素高值化为可能的一锅法胶体木质素分散体，首先评估了DES木质素自组装的倾向。由于反应性DES提取引起的主链主要修饰涉及在β-O-4芳基醚键的α-位引入羟乙氧基部分，因此确定整体疏水性变化对木质素聚集倾向的影响至关重要。从这个角度出发，通过两种涉及溶剂-反溶剂策略的不同方法合成了LNPs。更具体地说，首先通过将对甲苯磺酸钠水溶助长剂溶液溶解然后通过水介导的纳米沉淀获得LNPs。
或者，在pH骤降诱导闪蒸沉淀法中，通过将硝酸溶液快速加入到乙二醇（EG）/木质素溶液中，快速降低pH值来建立胶体系统。这种与水的反溶剂行为相关的pH骤降触发了DES木质素的过饱和，随后是成核和颗粒生长。
将获得的LNPs与从二恶烷木质素合成的类似胶体悬浮液进行比较。这些颗粒显示出亚微米范围内的流体动力学半径。发现DES_LNPs比相应的二恶烷_LNPs稍大。由于仪器在1 μm以上的灵敏度限制，使用DES木质素作为起始材料，通过水溶助长法对较大聚集体进行可重复分析的努力面临限制。这些聚集体的存在可归因于初级纳米颗粒的低胶体稳定性，这些颗粒聚结形成更大的聚集体。此外，溶液显得浑浊，表明存在相当于或大于400–700 nm的颗粒。DES纳米颗粒溶液保持稳定长达8小时，之后发生沉降。一个月后，上清液变得透明无色。
二恶烷LNPs显示的流体动力学半径和ζ电位值与从DES提取的木质素在120°C处理4小时（ChCl:EG:OA摩尔比1:2:0.3）获得的值相似。然而，二恶烷LNPs的浑浊橙色胶体悬浮液保持稳定长达三个月。从pH诱导闪蒸沉淀法中获得了令人鼓舞的结果，产生了半径为200 nm、ζ电位为25 mV的颗粒，落在纳米颗粒的稳定性范围内。来自DES木质素（120°C，2小时，ChCl:EG:OA摩尔比1:2:0.3）的溶液呈浅棕色且透明。
来自DES提取木质素的木质素纳米颗粒的稳定与DES分馏期间引入的结构修饰和纳米颗粒形成途径密切相关。β-O-4键苄位的乙二醇掺入可能增加了木质素的极性并减少了分子间π–π堆积，而较低的缩合程度有利于受控的自组装而不是不可逆的聚集。在水溶助长法中，纳米颗粒从溶解状态逐渐稀释形成，而pH诱导闪蒸沉淀则产生快速过饱和和增强的静电排斥，导致更小、更稳定的纳米颗粒，这反映在其ζ电位值上。
简而言之，这项研究证明了通过两种不同的方法成功生产了木质素纳米颗粒：水溶助长沉淀和pH诱导闪蒸沉淀。动态光散射（DLS）分析表明纳米颗粒呈单峰分布，流体动力学半径受木质素功能化程度的影响。ζ电位测量提供了有价值的见解，突显了两种方法和两种木质素类型之间的差异。具体而言，使用DES木质素通过水溶助长工艺生产的纳米颗粒倾向于聚集并表现出不稳定性，而通过pH诱导闪蒸沉淀法合成的纳米颗粒尺寸更小，并在整个研究过程中保持稳定。
4. 结论
在这项工作中，对从基于二醇的DES中分离木质素进行了系统研究。通过调整DES的组成和改变分馏条件，获得了具有可调性质（如芳基醚键含量和分子量）的木质素。其中，用高EG/ChCl（高于2）制备的DES分离出具有更好芳基醚键保存和较高分子量的木质素。相对较高的温度（160–180°C）结合较长的保留时间（2–6小时）导致较高的木质素产率，而中等温度（80–120°C）和高EG/ChCl比率（≥2）促进了具有更高芳基醚键保存率的木质素的分离。这些结构特征直接转化为改善的自组装行为和增强的胶体稳定性，当通过pH诱导闪蒸沉淀法制备时，DES_LNPs的半径为200 nm，ζ电位为25 mV。此外，令人信服地证明了该方法可以扩展到一系列不同的生物质类型，尽管从不同生物质中分离的木质素各不相同。从DES木质素获得的LNPs的多功能性为开发从木材直接合成LNP的一锅法程序铺平了道路。总体而言，这项研究表明，基于二醇的三元DESs在分离具有定制性质的木质素方面具有独特的性能，本工作中提供的数据为理解不同条件下木质素的结构变化提供了宝贵的见解。
