《Microchemical Journal》：Ultrasound-assisted micellar extraction coupled with chitosan mediated charge flocculation: a green and efficient strategy for the extraction and separation of dihydroquercetin from
Larix gmelinii
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高效绿色提取分离落叶松二氢槲皮素的研究综合运用超声波辅助SDS胶束萃取和壳聚糖电荷介导絮凝技术，通过优化固液比1:25、SDS浓度8%、超声功率100W、时间40min实现高效萃取，絮凝条件优化后DHQ回收率达96.89%，结合抗溶剂重结晶得到92.82%高纯度DHQ，DFT理论计算揭示电荷中和与范德华力主导的絮凝机制，显著降低有机溶剂使用。
吕月|贾文强|朱文|王中娟|唐翠曼|孙超凡|赵秀华
教育部东北林业大学森林植物生态学重点实验室，中国黑龙江省哈尔滨市150040
摘要
本研究提出了一种结合超声辅助胶束提取和壳聚糖（CS）介导的电荷絮凝的新方法，用于从Larix gmelinii中绿色高效地提取和分离二氢槲皮素（DHQ）。该方法使用了十二烷基硫酸钠（SDS）胶束体系，在优化条件下（固液比为1:25?g/mL、SDS浓度为8%、超声功率为100?W、提取时间为40?min）实现了DHQ的高效提取。随后，创新性地引入了天然聚合物壳聚糖作为电荷介导的絮凝剂。壳聚糖上的正电荷与SDS胶束表面的负电荷之间的静电吸引力使胶束聚集成微米级絮体，从而实现DHQ的一步富集和分离。在最佳絮凝条件下（壳聚糖用量为25?mL、温度为20?°C、pH值为5、絮凝时间为0.5?h），DHQ的絮凝效率高达96.89%?±?2.37%。最后，通过乙酸乙酯萃取和反溶剂重结晶，获得了纯度为92.82%?±?0.38%的DHQ。进一步利用密度泛函理论（DFT）计算揭示了絮凝机制。研究表明，壳聚糖与SDS之间的静电中和是絮体形成的驱动力，中和后的胶束颗粒通过范德华力聚集并沉淀。该方法显著减少了有机溶剂的使用，为高价值DHQ的制备和黄酮类化合物的分离提供了一种新的绿色方法。
引言
森林来源的生物活性物质是一类在森林生物资源的生理代谢过程中形成的天然生物分子，具有治疗或预防疾病的作用，是制药和食品工业的重要原料[1]。森林植物资源种类繁多，含有大量的可再生生物活性物质，具有巨大的工业开发潜力[2]。作为植物的生理代谢产物，森林来源的活性物质具有含量低、化学结构复杂多样且分离困难的特点。与传统提取技术（如煎煮、回流提取）[3]、[4]相比，超声[5]和微波[6]等新兴提取技术显著提高了提取效率。然而，森林来源的活性物质提取过程中仍存在能耗高、环境污染和成本高的问题。为了响应绿色低碳循环经济体系，将先进提取技术与绿色溶剂相结合，建立操作简单且高效的绿色提取方法具有重要的研究意义。
表面活性剂分子同时具有亲水基团和疏水基团[7]。当其溶解在水中时，超过临界胶束浓度（CMC）的表面活性剂会促使疏水基团自发聚集形成胶束，亲水基团朝向水相，形成外亲水内疏水的结构[8]。胶束内部的疏水微环境通过分子间作用力（疏水相互作用、静电作用、氢键等）使疏水物质溶解在胶束核心或界面，而亲水外壳则稳定其在水溶液中的分散状态，从而实现从原料中提取疏水成分[9]。与传统分子溶剂相比，胶束作为提取溶剂具有温和高效的提取能力，适用于复杂体系，能显著降低提取成本，符合可持续发展的理念，是一种新型的绿色提取溶剂[10]。根据目标成分的结构和性质差异，添加不同类型的表面活性剂可以更有效地捕获它们，表现出优异的复合性能[11]。因此，作为一种新型的绿色环保提取溶剂，胶束在植物活性成分的集成加工和利用方面具有巨大潜力。然而，关于胶束提取的研究也揭示了其局限性。例如，在使用Tween 80胶束从苹果树枝中提取黄酮类化合物时，发现随着表面活性剂浓度的增加，体系粘度急剧上升，物质扩散速率明显低于分子溶剂[12]。因此，需要结合现代提取技术来增强传质效果。将超声辅助提取技术与绿色胶束溶剂结合用于森林资源的生物活性物质提取是一种可持续、高效且节能的策略。
Larix gmelinii主要分布在中国、俄罗斯和其他远东地区[13]。作为一种重要的森林资源，它含有丰富的生物活性物质，具有多重经济和生态价值。研究表明，多酚类化合物是松科植物中的重要成分，具有显著的抗氧化活性[14]。其中，DHQ是Larix gmelinii中的主要生物活性成分之一[15]。DHQ是一种天然存在的二氢黄酮醇化合物[16]，具有抗氧化[17]、降低血压[18]和抗炎[19]等作用。最近，DHQ已被欧盟批准作为新型食品成分，并广泛应用于制药[20]、功能性食品[21]、化妆品[22]等领域。随着市场需求的增加，开发DHQ的提取和分离方法变得十分必要。
絮凝技术是一种利用絮凝剂处理不稳定胶体溶液或悬浮液，使其变得清澈稳定的分离技术。该过程通过聚合物絮凝剂的静电中和、吸附桥接、捕获和扫集作用，使系统中的固体颗粒、胶体颗粒和大分子物质聚集形成大而致密的絮体[23]。由于操作简便、生产周期短和成本低，絮凝技术被广泛用于去除杂质和分离活性成分[24]。絮凝剂可分为无机絮凝剂、合成有机絮凝剂和天然聚合物絮凝剂，如壳聚糖、海藻酸钠、纤维素、木质素和微生物絮凝剂[25]。无机和有机絮凝剂因其有效的絮凝活性和低成本而在当前工业中最为常用。然而，它们的应用存在环境污染风险。近年来，基于多糖的生物絮凝剂在废水处理、采矿、制药和发酵工业中受到广泛关注[26]。这些絮凝剂具有环境友好性、可生物降解性和良好的分子结构特性等优势。壳聚糖是甲壳素的脱乙酰衍生物，是一种天然氨基多糖。其分子结构不含合成聚合物絮凝剂中可能存在的有毒单体，使其成为最有前景的天然替代品[27]。值得注意的是，由于含有伯氨基，壳聚糖在生物聚合物絮凝剂中表现出独特的絮凝性能，无需改性即可发挥絮凝作用。
本研究开发了一种结合超声辅助胶束提取和电荷介导的壳聚糖絮凝的新工艺，用于高效分离Larix gmelinii中的DHQ。首先，根据DHQ提取率和饱和溶解度的双重因素筛选了12种不同的表面活性剂，确定最佳表面活性剂类型。随后通过单因素实验系统研究了固液比、表面活性剂浓度、超声功率和提取时间对DHQ提取率的影响，以确定最佳提取条件。在分离阶段，评估了不同分子量的壳聚糖对DHQ絮凝率的影响。以DHQ的絮凝率为指标，优化了壳聚糖用量、絮凝体系pH值、絮凝温度和时间，以确定DHQ分离的最佳絮凝条件。此外，还确定了DHQ分离的最佳提取溶剂，并通过反溶剂重结晶提高了DHQ的纯度。利用DFT研究了分离机制，为该方法提供了坚实的理论基础。最后，使用AGREEprep系统评估了本研究的绿色程度。这种简单全面的提取-分离方法在最大化DHQ纯度的同时，最大限度地减少了环境污染和经济成本，为未来的大规模生产带来了希望。
材料
Larix gmelinii的木质部（木质部中DHQ总含量为31.7?mg/g）由黑龙江省牡丹江市凌台药业有限公司提供。干燥后将其粉碎至60目并储存在干燥器中。DHQ标准品（纯度>98%）购自上海源业有限公司。十二烷基硫酸钠（SDS）、椰油酰胺丙基甜菜碱（CAB）、十二烷基二甲基甜菜碱（BS-12）、茶皂苷（TSAP）、Tween-60（T-60）、Tween-80（T-80）、Span-80（S-80）等试剂也用于实验。
表面活性剂溶剂筛选
在提取过程中，选择廉价、易获取且环保的提取溶剂对目标化合物的提取至关重要。因此，我们评估了12种常见表面活性剂（SDS、CAB、BS-12、TASP、T-60、T-80、S-80、APG1214、PEG-400、SOS、SLES和APG10）对DHQ提取率的影响，采用超声提取方法进行了实验。
结论
本研究基于阴离子表面活性剂的特性，通过壳聚糖的电荷介导作用实现了DHQ的绿色提取和分离，并最终通过有机试剂提取和反溶剂重结晶获得了高纯度的DHQ。在超声辅助SDS胶束提取的基础上，进一步研究了DHQ提取物的分离过程，并探讨了壳聚糖的絮凝和分离机制。
作者贡献声明
吕月：撰写——原始稿件、验证、方法学、实验设计、数据整理。
贾文强：撰写——审稿与编辑、验证、方法学、实验设计。
朱文：撰写——审稿与编辑、概念构思。
王中娟：撰写——审稿与编辑、验证。
唐翠曼：撰写——审稿与编辑、数据分析。
孙超凡：撰写——审稿与编辑、软件应用。
赵秀华：资源获取、项目管理、资金筹集、概念构思。
利益冲突声明
作者声明没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
作者感谢匿名审稿人的宝贵意见和细致的修改建议。本研究得到了黑龙江省发展规划项目（2022ZX02C11）的支持。
