综述：藻酸盐水凝胶的当前凝胶化技术与新型CO2诱导凝胶化：在生物材料中的应用

《Next Materials》：Current gelation technologies for alginate hydrogels and novel CO 2-induced gelation: Applications in biomaterials

　　

藻酸盐凭借其优异的安全性、生物相容性以及通过二价阳离子形成“蛋盒”（egg-box）结构水凝胶的能力而被广泛用作生物材料。迄今为止，多种凝胶化技术已被开发；然而，使用碳酸钙（CaCO₃）的内部凝胶化方法因其能控制凝胶形态并改善结构均一性而备受关注。但该方法通常需要添加酸化剂以促进Ca²⁺从CaCO₃中释放，从而会导致凝胶pH降低，并可能对生物相容性产生不利影响。为应对这一难题，近期研究探索了提高生物相容性的替代凝胶化策略，包括使用二氧化碳（CO₂）作为酸化剂。在该方法中，CO₂在凝胶化过程中充当临时酸化剂，凝胶化结束后则从凝胶中逸出，从而抑制凝胶化后的酸化。此外，该凝胶化方法还能通过与其他聚合物杂化实现对细胞黏附的调控，从而拓宽了凝胶作为生物材料的应用范围。已研究表明，CO₂的使用还可以促进多孔网络结构的形成，增强营养物质和气体的渗透性，并有助于细胞迁移，进而促进细胞组织形成。本综述总结了CO₂诱导藻酸盐水凝胶在生物医学领域的研究进展，并进一步讨论了将藻酸盐水凝胶–CO₂相互作用拓展至藻类培养中作为环境领域应用的潜力。

1. 引言
离子交联水凝胶作为生物材料因其高生物相容性、温和的凝胶化条件以及与生物组织相似的力学和功能特征而备受关注。天然多糖在形成稳定的交联网络方面受限于羧基或硫酸酯等官能团缺乏或稀少。其中，藻酸盐及低甲氧基（LM）果胶可与钙等二价阳离子形成稳定的蛋盒（egg-box）结构，并进一步超分子组装实现水凝胶化。此类水凝胶广泛应用于药物递送、伤口敷料和组织工程。然而，现有的外部凝胶化和内部凝胶化技术各有局限，特别是内部凝胶化使用酸化剂可能造成pH降低，影响细胞活性。新型的CO₂诱导凝胶化方法因临时酸化、事后逸出而制备改善生物相容性的水凝胶，展现出广阔的应用前景。
2. 基于蛋盒结构的水凝胶凝胶化技术
2.1 聚合物结构与凝胶化
藻酸盐是从褐藻中提取的聚糖多糖，由1,4-连接的β-D-甘露糖醛酸（M）和α-L-古罗糖醛酸（G）残基组成。藻酸盐的G嵌段与Ca²⁺形成强离子交联，形成特征性的蛋盒结构，使凝胶具备良好的机械完整性与稳定性。低甲氧基果胶（LM果胶）保留了较多游离羧基，同样可与Ca²⁺形成蛋盒结构并发生凝胶化。这两种聚合物的组成、酯化程度和G残基分布显著影响凝胶动力学、力学强度及降解行为。
2.2 外部凝胶化法
外部凝胶化法是将聚合物溶液直接暴露于拉CalCl₂溶液等含有二价阳离子的溶液，发生羧基与Ca²⁺的迅速离子相互作用，引发瞬时凝胶化。通过滴注藻酸盐溶液至Ca²⁺溶液可以实现液滴表面瞬时凝胶化，形成“人造囊腔”状球形凝胶。此类凝胶广泛用于药物递送、口服制剂和细胞支架，通过改变氯化钙溶液和聚合物溶液间相对表面张力，可获得形状稳定的凝胶珠。外部凝胶法还能够通过施加剪切力（例如旋转氯化钙溶液）制备海藻酸盐纤维，诱导纤维表面产生因Kelvin–Helmholtz不稳定所形成图案。经过胶原蛋白包被后的这类纤维在细胞粘附、排列和取向方面具有调控作用，可用于组织工程中的细胞引导平台。
2.3 内部凝胶化法
内部凝胶化法将难溶性钙盐（如CaCO₃）或螯合的钙离子分散于藻酸盐溶液中，并加入结合葡萄糖-δ-内脂（GDL）等酸液剂。GDL在水中缓慢水解释放葡萄糖酸，逐渐降低pH并使CaCO₃溶解，从而释放Ca²⁺从而实现多样化的、缓慢且可控的凝胶化。该方法可制备结构均匀、力学稳定的整体凝胶。基于内部凝胶化法，研究人员构建了胃蛋白酶提取胶原（PSC）–藻酸盐复合水凝胶，并显示低细胞毒性与可促进伤口愈合，可释放氧血管内皮生长因子。另一方，利用壳聚糖盐酸盐涂覆内源凝胶化得到的藻酸盐水凝胶，通过静电作用形成壳聚糖涂层；该涂层既延长亲水性药物从凝胶基质的释放，又通过壳聚糖的正电荷干扰细菌膜发挥抗菌作用。此外，掺杂银、银粒子、抗菌酞等策略也为藻酸基因水凝胶提供抗菌提供优势。
2.4 当前凝胶化方法的局限性
以CaCO₃为基础的内源凝胶化虽能调节凝胶形状和结构均匀性，但在生物应用方面关键挑战是体系中的酸化剂残余，例如GDL导致终pH低于4，以及降低pH环境细胞增殖（人成纤维细胞、角质形成细胞）等。这种不良酸化效应严重降低了水凝胶的生物相容性，从而限制了其生物医用价值。因此在保持蛋盒结构优点同时，亟需开发不使最终凝胶中酸化的新型凝胶化技术。
2.5 CO₂诱导凝胶化
为了应对上述凝胶的酸化问题，新型凝胶化方法引入CO₂作为临时酸性化剂的高溶压或超临界CO₂体系已被用于海藻酸盐、LM果胶及其他生物高分子的凝胶化。在内部凝胶化过程中，CO₂溶解于水后生成二元酸，释放质子从而降低pH，促使CaCO₃溶解并析出Ca²⁺，这些离子与聚合物链交联形成水凝胶。在凝胶化完成后CO₂自凝胶基质挥发逸散，pH恢复至中性或弱碱性，可避免残酸影响。通过高压CO₂（5 MPa，298 K）处理海藻酸钠/CaCO₃混合物可以凝胶化并干燥后得到气凝胶，且该凝胶也适用于LM-果胶。部分研究表明若仅用螯合Ca²⁺而不加入CaCO₃，在CO₂释放后凝胶可能因Ca²⁺再螯合、交联逆转转化而变得不稳定，因此CaCO₃对形成稳定凝胶位置。碳酸度水凝胶技术上更加简便，将碳酸钠海藻酸钠和CaCO₃溶液与碳酸水混合10秒即可在室温下形成凝胶。用溴百里酚蓝（BTB）监控pH变化显示，CO₂的散失导致凝胶从黄逐渐变蓝，空气面起初变色并反向内部扩展，最终pH稳定在约8.5，此适合血液细胞。且CO₂释放速率依赖于凝胶厚度，厚度增大使CaCO₃溶解更多、交联密度更高并增大Young's弹性模量。与外源凝胶和GDL等内源凝胶产生相比，CO₂诱导凝胶兼有结构可控和不残留酸的优点，但凝胶性能仍待系统了解。
3. CO₂诱导凝胶化制备的水凝胶在生物材料中的应用
3.1 凝胶的细胞相互作用控制
藻酸盐与LM果胶水凝胶因为带大量负电荷的羧基和低蛋白吸附能力而细胞黏附较差。为适用于组织工程块体，需要对细胞–凝胶相互作用进行调控。近年，采用在藻酸分子上共价修饰RGD类细胞黏附肽（如RGD）研究颇多。在RGD修饰的海藻糖支架中，新生大鼠心肌细胞排列出规则的a-肌动蛋白，肌节结构明显好于未修饰支架；同时这些基因中N-钙粘蛋白和连接蛋白Cx43表达含量更高，表明RGD序列有利于促进心肌细胞增殖。然而RGD过多修饰会消耗参与Ca²⁺交联的羧基，导致交联密度下降。另外以海藻的M/G比例影响修饰后的凝胶性质；高G的海藻凝胶，即使采用相同修饰，也对成肌细胞具有更好的增殖分化促进作用。另一种调节细胞反应的策略是与促进细胞黏附的天然高分子“杂化”互穿网络（互穿网络，IPN）而不是修饰藻酸羧基，如透明质酸/海藻酸钠双网络结构。这种聚性的EPN能够支持人脂肪间充质干细胞（hADSCs）的附着、增殖并促进软骨分化。因此，通过改变羧基修饰或聚合物杂合在一定程度上能够调控藻酸基水凝胶的细胞反应，从而提升生物材料应用潜力。
3.2 作为生物材料的应用
3.2.1 伤口敷料方面
含CO₂诱导的藻酸水凝胶（例如利用碳酸水制备的凝胶，记作Alg-Ca0.20）表面pH为约8.5，更适合人皮肤细胞。与已临床使用的低黏附敷料VIEW GEL?相比，该水凝胶对皮肤的黏附性低约11.9–16.5倍，溶胀率低约1.9倍。在损坏小鼠伤口敷料实验中，VIEW GEL?早期会使伤口面积暂时增加，可能是由于敷料吸收大量渗出液引发过度膨胀；而Alg-Ca0.20的低黏附及低溶胀性能抑制了伤口不必要的扩张，有利于破坏正常组织的二次损伤现象。因此CO₂诱导凝胶化能够制备适用于创伤处理的敷料。
3.2.2 组织工程应用
CO₂诱导凝胶化能够在凝胶内形成多孔网络结构，而孔隙状态对支架功能非常关键。研究表明，调节高压CO₂引入压力和卸压速度可以控制藻酸盐（或藻酸盐/质碳）气凝胶的参数。例如当卸压速度为高时（50 bar/s），得到大孔结构较为粗大；低卸压速度下压力的升高使孔径减小、分布变窄，因为高CO₂浓度易促成更致密的离子交联。藻酸盐–基凝胶也具有较高的大孔率及孔间连通性。在藻酸盐–木质素杂化气凝胶中研究报告，大孔率可达31.3±1.9%，平均孔径220±18 μm，远高于促进细胞生长所需的最小孔径（38–63 μm）。间接细胞毒性结果发现与普通培养板（TCP）的细胞活性相似，直接细胞培养时后期（第3–7天）增殖上升，表现良好生物相容性及有利于细胞粘附和活性。类似地，以代替木质素的藻酸盐–淀粉杂化气凝胶在培养L929细胞时，1天后基质表面粗糙可见，7天后细胞完全覆盖表面；Alamar Blue测试细胞活力在第3、7天较第1天显，显着增加，这显示该可降解支架具备适合组织和骨组织应用。
4. 藻酸盐水凝胶与CO₂相互作用的扩展：在环境领域中藻类培养中的应用
该章突破了CO₂仅作为瞬时凝胶触发剂的作用，探索藻酸盐水凝胶–CO₂相互作用在环境领域的生物应用构成。微藻具备很强固碳效率，是蓝碳/绿色碳的重要来源。但传统液态悬浮培养存在细胞回收能耗高、易受等污染。利用藻酸盐凝胶将微藻包埋培养的“固化培养”策略，通过藻酸盐温和离子交联凝胶化密度包载藻，这有利于保护藻，细胞提供微环境并保持光合和代谢活性，同时实现营养物质和气体的质量传递。该技术已应用于小球藻（Chlorella vulgaris）、斜生栅藻（Scenedesmus obliquus）和小球藻（Chlamydomonas reinhardtii）等在间歇端连续运行模式上稳定培养。藻酸包埋可以压制了细胞洗出，并使细胞密度水平显著提高。在正常废水和重金属浓度高的环境中，凝胶基质内的藻类可保护细胞免受有毒金属干扰。相比需要热处理的其他凝胶（如琼脂、卡拉胶）会导致热损伤，藻酸盐水凝胶可在温和、水溶液环境下与Ca²⁺交联，保持高细胞活力。因此藻酸包合藻类作为生物CO₂汇具有较大潜力；实现关键参数是培养时长和高流量引起凝胶变形。
5. 未来研究
虽然CO₂诱导的藻酸水凝胶在组织工程和先进创面修复领域展现出前景，但从当前看仍存在重要有待解决的关键问题。首先是CO₂产生的多孔结构在三维（3D）细胞培养环境中的作用尚未完全阐明。例如，所有说明多孔结构是否能促进细胞–细胞的沟通、组织成熟和功能化组织未被定量验证。现有实验表明，三维支架上的细胞活性与二维培养皿相比没有显著提高，提示过度的孔隙或不足的力学信号可能限制了细胞节点作用。因此，需要对孔径分布、连通性、机械性能与细胞反应之间的关联开展系统研究。其次是CO₂扩散和释放动力学的控制问题，CO₂挥发影响内部pH变化、Ca²⁺释放及交联密度，进一步解释凝胶的力学稳定性和生物性能。未来应关注长期生物相容性、体内生物降解、宿主组织反应以及制备参数标准化，以推动临床转化。此外，环境领域海藻–CO₂生物杂化系统尽管具有优势，但机械强度不足和长期稳定性差仍是制约其规模应用的因素。最近的双网络结构和单宁增强等策略改善机械强度，并已尝试用于3D打印，以得到可控制性能的结构，这有望进一步发展藻酸盐内CO₂生物吸收的功能。
6. 结语
本综述总结了以海藻酸盐为主的海藻糖，基于蛋盒结构的凝胶化技术现状和挑战，并介绍了CO₂诱导凝胶化的研究进展。传统GDL等酸性剂制备的凝胶虽能控制结构，但往往含有残余酸而降低生物相容性，不便医学应用。CO₂诱导凝胶化则相反，凝胶化完成后CO₂逸出，pH恢复正常中性或碱性，从而保持细胞活力；同时，该法可形成多孔网络，提高营养氧气的扩散，适合组织工程和创面敷料。重要的是，将海藻酸盐–CO₂相互作用扩展到环境领域，还可在凝胶中加入微藻，从而用于生物固碳。此后续极的研究除了聚焦优化CO₂的水物理、长期稳定性、体内相容性等关键指标，以期使其在生物材料领域发挥更广泛的作用。