双相结构3D打印骨垫片的创新设计：鱼源性羟基磷灰石与商业羟基磷灰石在骨缺损治疗潜力中的对比研究

《ACS Applied Bio Materials》：3D-Printed Bone Spacers with Dual-Phase Structure: A Comparison of Biogenic and Commercial Hydroxyapatite for Potential Treatment of Bone Defects

本研究成功利用挤出式3D打印技术制备出具有致密外壳和多孔内核双相结构的骨垫片，并对比评估了鱼源性羟基磷灰石（Bio-HAp）与商业羟基磷灰石（Co-HAp）的理化特性、微观结构、力学性能及体外细胞相容性。结果表明，Bio-HAp骨垫片具有更高的总孔隙率（约51%），而两者压缩强度和模量与人体骨骼相当，且细胞存活率均超过96%，展现出良好的生物相容性。这项工作为骨缺损修复提供了一种具有仿生结构、可定制的生物陶瓷垫片新策略。

　　

引言

由创伤、感染或手术引起的骨缺损是骨科治疗中的重大挑战。目前，骨缺损的管理通常需要使用骨移植物或合成垫片来提供临时结构支撑并促进骨再生。自体骨移植被认为是“金标准”，但存在供区并发症、供应有限等限制。异体骨移植则存在免疫排斥和疾病传播的风险。因此，可生物降解且具有生物活性的材料作为骨垫片受到了广泛关注。其中，钙磷（CaPs）材料因其生物相容性、与天然骨矿物的相似性以及骨传导特性而备受青睐。羟基磷灰石（HAp，化学式Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂）是CaPs家族中的重要成员，具有与天然骨相似的结晶度以及生物活性和可吸收特性，在骨科应用中潜力巨大。

近年来，鱼鳞作为HAp的来源展现出巨大前景。鱼鳞是渔业丰富的副产品，为HAp的可持续、低成本制备提供了可能，其衍生材料具有独特的特性，可能更适合生物医学应用。然而，大多数已报道的HAp骨替代物仍基于完全致密或均匀多孔的结构，这种简化的设计往往需要在机械稳定性和生物功能之间进行权衡。受天然骨分层结构（致密的皮质骨外层提供强度，多孔的松质骨内核允许营养物质和细胞通过）的启发，本研究采用挤出式3D打印技术，设计并制造了一种具有致密外壳和多孔内核的双相结构骨垫片，旨在模拟天然骨结构，同时提供足够的机械稳定性和支持细胞附着、增殖及后续组织形成的支架特性。

材料与方法

材料：本研究使用的生物源性羟基磷灰石（Bio-HAp）来源于泰国春武里府采集的海鲈鱼鱼鳞。商业羟基磷灰石（Co-HAp，粒径5 μm）购自Sigma-Aldrich。使用羟丙基甲基纤维素（HPMC）作为HAp膏体制备的粘结剂。

Bio-HAp粉末制备：采用碱热处理方法从海鲈鱼鳞中提取Bio-HAp。简要步骤包括：首先用0.1 M盐酸在室温下搅拌1小时进行脱蛋白处理，然后用5% (w/v) 氢氧化钠溶液在60°C下搅拌处理7小时进行碱热处理，随后用去离子水中和，并通过热风烘箱干燥、研磨和过筛（<45 μm）得到Bio-HAp粉末。

骨垫片制备：使用3D生物打印机（Dr. INVIVO 4D2）制造骨垫片生坯。将Bio-HAp粉末与1% w/v HPMC（溶于30%乙醇）以50%固含量混合制备打印膏体。双相结构模型（圆柱形，15 × 10 mm）通过软件设计，具有3 mm厚的致密外壳和30%填充密度的多孔内核。打印参数包括：喷嘴直径0.6 mm，层高0.3 mm，打印速度2 mm/s等。打印完成后，生坯在40°C烘箱中干燥过夜，随后在马弗炉中按特定升温程序进行烧结。Co-HAp骨垫片采用相同步骤制备以供对比。

表征与分析：

1. 1.
   Bio-HAp粉末表征：使用场发射透射电子显微镜（FE-TEM）观察形貌，并通过配备的能谱仪（EDS）分析元素组成和Ca/P原子比。
2. 2.
   骨垫片表征：
   • •
     收缩率、密度与孔隙率：使用游标卡尺测量烧结前后尺寸，通过阿基米德原理测定密度和孔隙率。
   • •
     晶体结构与物相：使用X射线衍射仪（XRD）分析烧结后样品的晶体结构和物相。
   • •
     形貌与微观结构：使用扫描电子显微镜（SEM）观察生坯及烧结后（压缩测试断裂后）样品的形貌和微观结构。
   • •
     力学性能：使用万能试验机（UTM）进行压缩测试，直至样品失效，以测定最大应力、压缩屈服强度与应变以及压缩模量。
   • •
     体外细胞活力与毒性评估：使用人软骨粗细胞（HCPCs）进行活/死细胞染色实验，培养1、3、7天后，通过共聚焦显微镜观察并计算细胞存活率，评估材料的细胞相容性。

结果与讨论

Bio-HAp粉末的特性：FE-TEM图像显示，Bio-HAp颗粒主要为纳米级的棒状结构，同时也存在不规则形状和团聚现象。EDS分析表明其Ca/P原子比为1.67，符合化学计量HAp的特征，并检测到微量的镁（Mg）元素，这来源于生物源HAp，对增强生物活性和促进骨形成有积极作用。

骨垫片的特性：

1. 1.
   收缩率、密度与孔隙率：烧结后，Bio-HAp骨垫片的线性和体积收缩率分别为21.00 ± 0.35% 和 52.09 ± 0.54%，低于Co-HAp骨垫片（26.38 ± 0.86% 和 61.07 ± 1.18%）。Bio-HAp骨垫片的总孔隙率（51.13 ± 2.94%）高于Co-HAp骨垫片（44.38 ± 1.01%），更高的孔隙率有利于促进成骨细胞生长和矿化基质形成。
2. 2.
   晶体结构与物相：XRD图谱显示，两种骨垫片在烧结后均保留了纯的HAp相，没有发生相变，且显示出高结晶度。主要衍射峰与标准HAp图谱一致。
3. 3.
   形貌与微观结构：SEM图像揭示了两种材料在生坯和烧结状态的形貌差异。Co-HAp生坯由球形颗粒组成，结构相对均匀；而Bio-HAp生坯由不规则形状颗粒组成，堆积结构较松散。烧结后，两者均发生致密化，但Co-HAp颗粒融合更充分，形成更致密的微观结构；Bio-HAp则因颗粒形状不规则，存在更多的残留孔隙和未完全形成的颈状连接。断裂表面分析显示两者均为沿晶界扩展的脆性断裂。
4. 4.
   力学性能：应力-应变曲线显示两种垫片均表现出脆性材料特性。Bio-HAp骨垫片主要表现为单步失效，而Co-HAp骨垫片则表现出两阶段变形行为，这可能与打印结构的各向异性和内部缺陷有关。Bio-HAp骨垫片的极限抗压强度和压缩模量分别为14.69 ± 3.79 MPa和1028.76 ± 426.19 MPa，Co-HAp骨垫片则为15.91 ± 0.91 MPa和901.95 ± 89.28 MPa。两者数值无显著差异，且均落在人体骨骼的力学性能范围内（抗压强度约0.1-200 MPa，压缩模量120-17,000 MPa）。
5. 5.
   体外细胞活力与毒性：活/死细胞染色实验表明，在1、3、7天的培养期内，Bio-HAp和Co-HAp骨垫片上的细胞存活率均超过96%，与对照组无显著差异。这证实了两种材料均具有良好的体外细胞相容性，鱼源性HAp的生物相容性可与商业HAp相媲美。

结论

本研究成功利用3D打印技术制备了具有双相结构（致密外壳和多孔内核）的骨垫片，并系统比较了鱼鳞源性HAp与商业HAp的性能。结果表明，鱼源性HAp骨垫片具有更高的孔隙率，而两种材料在压缩强度、模量以及体外细胞相容性方面均表现相当，且力学性能与人体骨骼匹配。双相结构设计模仿了天然骨的层次结构，致密外壳提供了机械稳定性和结构完整性，多孔内核则有利于物质传输和细胞活动。综上所述，鱼鳞衍生的Bio-HAp作为一种可持续的天然来源材料，是商业HAp的可行替代品，所开发的双相HAp骨垫片在骨缺损修复应用中展现出良好的潜力。这项研究为基于生物源材料的定制化骨修复器械开发提供了新的见解和策略。