《Bioresource Technology》：Structural evolution-based ancestral sequence reconstruction of medium-chain alcohol dehydrogenase for efficient synthesis of fused-ring chiral alcohols
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环状手性醇药物分子合成中，通过整合酶序列和结构演化信息，成功重建并筛选出具有高热稳定性（熔点提升9.9℃）、优异催化性能（平均转化率和选择性达98%）的中链醇脱氢酶N42。该研究首次揭示MDR家族独特的功能调控位点，为酶定向进化提供新策略。
王俊|赵松胤|李乐航|朱曼曼|邹曼|苏欣|顾杰|徐岩|聂瑶
江南大学生物技术学院酿造微生物学与应用酶学实验室，教育部工业生物技术重点实验室，中国无锡214122
摘要
用于治疗复杂疾病的药物分子通常含有环状手性结构。特别是，通过化学方法合成稠环醇（例如手性β-四醇及其衍生物）具有挑战性。中链醇脱氢酶（MDR）被广泛用于潜在手性酮类化合物的非对称还原为手性醇，并可用于合成手性稠环醇。在这项研究中，我们将酶的序列信息和结构信息整合到了一种祖先序列重建方法中。该方法鉴定出了祖先中链醇脱氢酶N42，其对19种酮类底物（分为稠环、杂环和芳基类）的平均转化率和选择性均超过98%，并且其热稳定性也得到了提高（熔点比其后代高9.9°C）。计算分析解释了N42活性的起源，并揭示了MDR家族中一组独特的功能调控位点。这种祖先序列重建策略结合了序列和结构信息，为酶的发现和功能调控提供了新的见解，可能有助于研究结构差异较大的酶家族的功能进化。
引言
具有环状骨架的手性醇分子在药物中间体的合成中有着广泛的应用，占药物分子的至少20%（Gu等人，2025年）。其中，杂环醇（如S)-1-苄基-3-吡咯烷醇）、芳基醇（如S)-1-苯基-1-乙醇）和稠环手性醇（如S)-6-溴-2-四氢萘酚）分别是制备抗高血压药物（Zhang等人，2025年）、兽医抗生素（Leng等人，2025年）和抗心律失常药物（Vaz等人，2018年）的关键成分。尽管上述一些手性物质在化学合成领域取得了显著成就，但稠环手性分子在合成过程中仍面临挑战。
作为氧化还原酶家族的成员，中链醇脱氢酶介导C=O键的非对称还原，被广泛用于合成光学纯的手性醇（Qin等人，2021年）。大多数这些底物是非天然酶底物。因此，已经开发了多种酶工程策略来改造现有酶，以获得具有理想特性的突变体（Bayer等人，2025年；Chavan等人，2024年；Li等人，2024年；Su等人，2024年；Zhang等人，2024年）。其中，祖先序列重建（ASR）是一种独特的策略，它利用现有同源后代酶之间的进化关系，通过进化统计模型推断已灭绝酶的序列（Shi等人，2025年）。该过程通过多位点共突变扩展了序列空间。ASR技术已应用于多种跨类酶，包括几丁质酶（Kozome等人，2024年）、RNA聚合酶（Yagi & Tagami，2024年）、尿苷二磷酸糖基转移酶（Jian等人，2024年）、腈酶（Wang等人，2024年）、黄素依赖性单加氧酶（Chiang等人，2024年）和CRISPR-Cas核酸酶（Jabalera & Perez-Jimenez，2024年）。尽管ASR取得了优异的结果，但现有研究仍存在一些局限性。传统的ASR主要利用序列级信息，基于序列同源性筛选后代酶，并通过序列替换模型构建进化树。然而，与酶功能密切相关的结构信息尚未得到充分利用，而这影响到了祖先重建的准确性、可靠性和有效性。
近年来，测序技术的进步导致相关数据库中的酶序列数量迅速增加。AlphaFold的发展为许多之前结构未知或不清楚的蛋白质提供了新的见解，其数据库现在包含超过2亿个蛋白质结构（Wayment-Steele等人，2023年）。后续的结构分类工具快速完成了这些蛋白质的结构聚类，扩展了我们对蛋白质折叠的认识（Barrio-Hernandez等人，2023年）。新开发的结构进化工具将研究重点从主要基于序列进化的传统酶挖掘/转化方法转移开。Lakshmi等人通过构建结构进化树分析了脂质转运蛋白超家族的39个蛋白结构域（Helmer-Citterich等人，2015年）。结果表明，基于结构的系统发育聚类结果与功能多样性高度一致。Chen等人利用结构相似性检索和序列聚类方法发现了一种在80°C下可将d-果糖转化为d-塔格糖的塔格糖4-差向异构酶（Chen等人，2024年）。
在这项研究中，我们通过整合序列挖掘和结构进化策略，成功鉴定出一种具有更高热稳定性、更强活性和更高选择性的祖先MDR。此外，在典型的MDR家族中发现了一组可能具有新功能性的位点。我们期望这种独特的祖先序列重建方法未来可以应用于其他酶家族，并可能有助于结构差异较大的酶家族的功能进化研究。
试剂、质粒和菌株
实验中使用的底物、产品标准和辅酶均购自Macklin有限公司。HPLC流动相购自Aladdin有限公司（中国上海）。其他分析纯试剂来自Sinopharm Chemical Reagent有限公司。所有样品的纯度至少为97%。重组质粒pET-28a(+)和大肠杆菌 BL21(DE3)由天林生物技术公司（中国无锡）提供。
使用的酮类底物及其对应的醇产物
基于结构进化的祖先MDR的选择和表征
使用NBPD作为探针，我们根据序列长度检索并过滤了序列，去除了不合理序列，得到了255个序列。这些酶的后代的序列同源性为30–55%。通过OmegaFold预测这些酶的结构后，我们使用foldtree获得了它们的结构进化树（图1a）。结果显示，约67%的序列属于羟基酰基-CoA DH结构域，而6-羟基己酸DH类似结构域占
结论
通过结合序列信息和结构进化信息在祖先序列重建中的应用，我们鉴定出一种中链醇脱氢酶N42，其热稳定性高于NBPD，催化性能优异，对19种底物（包括稠环、杂环和芳基酮）的平均转化率和选择性高达98%。进一步制备和分离S)-6-溴-1,2,3,4-四氢-2-萘酚的结果表明
CRediT作者贡献声明
王俊：撰写——原始草稿、软件、方法学、数据分析。赵松胤：方法学、数据分析。李乐航：数据分析。朱曼曼：数据分析。邹曼：数据分析。苏欣：数据分析。顾杰：撰写——审阅与编辑、监督、数据分析。徐岩：资源提供。聂瑶：撰写——审阅与编辑、监督、软件、资源提供、项目管理、实验设计。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
感谢国家自然科学基金（NSFC）（编号22178147、22378168、22508142）、CPSF博士后奖学金计划（编号GZB20250577）、学科人才引进计划（111-2-06）、高端外国专家引进计划（编号G2021144005L）、国家顶尖青年人才支持计划以及江苏省高等教育优先学术发展计划的财政支持
