基于Cas-CLOVER基因编辑技术构建谷氨酰胺合成酶双敲除（GS-DKO）CHO细胞平台以显著提升抗体产量

《Biotechnology Progress》：Sequential, chromosome-specific glutamine synthetase double knockout with Cas-CLOVER establishes enhanced CHO platforms for cell line development

本文探讨了应用新型高保真基因编辑系统Cas-CLOVER，在悬浮适应型CHO-K1细胞中顺序敲除位于染色体5（GS5）和染色体1（GS1）的内源性谷氨酰胺合成酶（GS）基因，成功构建了双敲除（GS-DKO）宿主细胞平台（命名为CleanCut GS）。研究通过与CRISPR/Cas9对比，验证了Cas-CLOVER在GS5与GS1位点更高的编辑效率（84% vs. 57.4%；74% vs. 62%）及在40个预测脱靶位点均未检测到脱靶突变。该平台结合专有的Harbor-IN转座子系统稳定表达曲妥珠单抗后，在24深孔板补料分批培养14天后，细胞特异性生产力（Qp）超过100 pg/细胞/天，抗体滴度大于5 g/L，且产量稳定性可维持超过60代。本研究为生物制药工业提供了具有高生产效率、低脱靶风险的CHO细胞系开发新工具和新平台。

　　

1. 引言

中国仓鼠卵巢（CHO）细胞因其强大的悬浮生长能力、适应化学成分明确培养基、能够进行与人相容的糖基化以及在补料分批培养中实现高产，成为重组蛋白特别是治疗性抗体生产的主要表达系统。高效的细胞系开发（CLD）依赖于早期筛选高产CHO克隆的能力。谷氨酰胺合成酶（GS）选择系统是主流策略之一，其通过敲除内源性GS基因可增强选择严格性。研究表明，CHO细胞中主要GS基因位于5号染色体（GS5），而一个近期发现的假基因位于1号染色体（GS1）。为获得更彻底的代谢选择压力，需要同时敲除这两个位点。传统的CRISPR/Cas9系统在CHO细胞中脱靶编辑率较高（>10%），且有约7%的染色体重排风险，限制了其在工业CLD中的广泛应用。Cas-CLOVER是一种新兴的二聚体RNA引导核酸酶系统，具有高保真性且脱靶活性显著降低，为开发高产CHO宿主平台提供了有潜力的新工具。

2. 材料与方法

研究设计了靶向GS5外显子6和GS1外显子1（与GS5外显子4/5同源）的成对向导RNA（gRNA）。使用Neon^?电穿孔系统比较了Cas-CLOVER和Cas9在GS5和GS1位点的编辑效率。为构建宿主平台，将贴壁CHO-K1细胞逐步适应至无血清悬浮培养，并使用Cas-CLOVER通过核转染依次敲除GS5（生成GS5单敲除细胞系，GS5-SKO）和GS1（生成GS双敲除细胞系，GS-DKO）。通过单细胞克隆（SCC）筛选和Sanger测序验证基因型。利用Harbor-IN转座子系统（一种专有的转座酶），将包含曲妥珠单抗轻重链和GS转基因的表达框稳定整合到细胞基因组中。通过24深孔板补料分批培养评估抗体滴度和细胞特异性生产力（Q_p），并使用全基因组测序（WGS）分析脱靶效应。

3. 结果

3.1 Cas-CLOVER在GS编辑中展现出比Cas9更高的效率

在GS5位点，Cas-CLOVER实现了84%的编辑效率，而Cas9使用左、右单个gRNA分别为57.4%和30.4%。在GS1位点，Cas-CLOVER达到74%，Cas9则分别为62%和54.4%。这表明Cas-CLOVER在CHO-K1细胞中对GS位点的编辑效率显著优于Cas9。

3.2 Cas-CLOVER成功构建GS5单敲除与GS双敲除CHO细胞系

研究成功构建了GS5-SKO细胞系，并从筛选出的克隆中选择了7G2克隆进行后续实验。随后，在7G2基础上敲除GS1，获得了GS-DKO细胞系，最终选择F8克隆并命名为CleanCut GS平台。谷氨酰胺敏感性实验证实，GS5-SKO克隆在第9天完全丧失增殖能力，而GS-DKO克隆在第6天就已完全丧失，证明双敲除能实现更严格、更快速的代谢选择。

3.3 CleanCut GS细胞池及克隆支持高滴度曲妥珠单抗生产

将GS5-SKO细胞池和CleanCut GS细胞池分别用Harbor-IN系统表达曲妥珠单抗。14天培养后，GS5-SKO池的抗体滴度为1.65 g/L，Q_p为55.2 pg/细胞/天。而CleanCut GS池的滴度达到4.21 g/L，Q_p为83.9 pg/细胞/天，产量显著提升。从CleanCut GS池中筛选出的两个高产克隆（5G2和31H3）性能更优，滴度分别达到5.6 g/L和5.3 g/L，Q_p均超过100 pg/细胞/天，展现了卓越的生产能力。

3.4 CleanCut GS-TZ细胞池与克隆的抗体生产在60代内保持稳定

对CleanCut GS-TZ细胞池和5G2-TZ克隆进行长达60代的传代稳定性分析。结果显示，两者的抗体滴度和Q_p在传代过程中保持基本一致。数字PCR（dPCR）检测显示，Harbor-IN系统整合的曲妥珠单抗转基因拷贝数在60代内也保持稳定，证实了该平台具有长期稳定的生产能力。

3.5 Cas-CLOVER编辑在GS位点未检测到脱靶效应

对CHO-K1野生型、GS5-SKO克隆（7G2）和CleanCut GS克隆（F8）进行全基因组测序，并对CRISPOR工具预测的40个最可能的脱靶位点进行分析。在所有分析的脱靶位点中，均未检测到由Cas-CLOVER编辑导致的脱靶突变。仅在靶向位点发现了预期的缺失突变，证明了Cas-CLOVER系统的高特异性。

4. 讨论

本研究首次评估了Cas-CLOVER在CHO细胞中进行GS双敲除的效率和特异性，并将其与CRISPR/Cas9进行了比较。Cas-CLOVER凭借其二聚体设计，在编辑高度同源的GS1和GS5位点时表现出优异的精确性，有效避免了脱靶。所建立的CleanCut GS CHO细胞平台，结合了高效的GS双敲除选择优势和Harbor-IN转座子系统的稳定整合能力，能够快速生成高产、稳定的抗体生产细胞池或克隆。与既往仅使用CRISPR/Cpf1等工具的研究相比，本研究构建的平台在抗体滴度和细胞特异性生产力方面均取得了显著提升。这一集成平台为生物制药工业提供了一个加速细胞系开发进程、降低生产成本且不受复杂知识产权限制的实用解决方案。

5. 结论

综上所述，Cas-CLOVER是一种适用于工业CLD的高效、高保真基因编辑工具。利用它构建的CleanCut GS CHO宿主细胞平台，与Harbor-IN转座子系统相结合，能够快速开发出高产、稳定的生物制品生产细胞系。该平台的成功建立，为下一代生物制品的低成本、高效率制造铺平了道路。