利用生物活性指导方法从Tetracera alnifolia中分离和表征抗疟原虫和抗菌化合物

《RSC Advances》：Isolation and characterization of antiplasmodial and antimicrobial compounds from Tetracera alnifolia using a bioassay-guided approach

　　

初步生物学筛选表明，Tetracera alnifolia的叶片提取物对恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）和白色念珠菌（Candida albicans）表现出有希望的活性。为了确定产生这些作用的成分，研究人员随后采用了生物活性指导的分级分离策略。分级分离物使用快速色谱法（flash chromatography）进行纯化，随后采用半制备型高效液相色谱-二极管阵列检测-质谱联用（semi-preparative HPLC-DAD-MS）和液相色谱-固相萃取-核磁共振（LC-SPE-NMR）。通过全面的1D和2D核磁共振分析（NMR）结合高分辨电喷雾电离质谱（HR-ESI-MS）完成了分离化合物的结构解析。纯化的代谢物随后评估了其对恶性疟原虫和白色念珠菌的生物活性，并在MRC-5SV2人胎儿肺成纤维细胞中评估了其细胞毒性。总共从T. alnifolia叶片中分离出19个化合物（1–19）。其中，最强的抗疟原虫活性见于脱镁叶绿素-b甲酯（pheophorbide-b methyl ester）（1.0 ± 0.7 μM）、(1,2)-bis-nor-phytone（2.0 μM）、异植醇（isophytol）（4.0 μM）、脱镁叶绿素-a甲酯（pheophorbide-a methyl ester）（2.8 ± 1.2 μM）、表儿茶素-3-没食子酸酯（epicatechin-3-galloyl ester）（5.5 ± 2.1 μM）和植醇（phytol）（6.9 ± 2.4 μM）。其他化合物，包括杨梅素-3-O-鼠李糖吡喃糖苷（myricetin-3-O-rhamnopyranoside）、α-生育酚（α-tocopherol）和环阿屯-24-烯-3β-基α-亚麻酸酯（cycloart-24-en-3β-yl α-linolenate），表现出较低活性，IC₅₀值在13.5至25 μM之间。所有评估的化合物均未显示对白色念珠菌的抗真菌活性。值得注意的是，脱镁叶绿素-b甲酯、脱镁叶绿素-a甲酯和植醇表现出高细胞毒性。这些发现为T. alnifolia叶片提取物抗疟原虫活性的基础成分提供了见解。

**论文解读：基于生物活性指导分离的Tetracera alnifolia抗疟原虫及抗菌成分研究**

**研究背景与问题**

疟疾和真菌感染仍然是全球公共卫生的重大挑战，尤其耐药性病原体的出现亟需新型治疗药物。传统药用植物是发现先导化合物的重要来源。Tetracera alnifolia（五桠果科，Dilleniaceae）是一种分布于西非几内亚等地的藤本植物，在几内亚传统医学中广泛用于治疗皮肤疾病、口腔疾病、感染性疾病和疟疾。前期实验室筛选已显示其叶片的甲醇和二氯甲烷提取物对恶性疟原虫（Plasmodium falciparum，Pf）和白色念珠菌（Candida albicans，Ca）具有体外活性，但具体发挥作用的化学成分尚未明确。因此，本研究旨在通过生物活性指导的分级分离策略，从T. alnifolia叶片中分离并鉴定具有抗疟原虫和抗菌活性的代谢物，为开发新型抗疟和抗菌药物提供先导化合物。该论文发表在《RSC Advances》。

**主要关键技术方法**

研究人员采用生物活性指导的分级分离流程。起始材料为780 g干燥T. alnifolia叶片（2017年6月采集于几内亚Telimélimé，凭证标本D42HK2存放于几内亚药用植物研究与开发中心）。经正己烷脱脂和80%甲醇提取后，获得正己烷相（TE）、二氯甲烷相（TD）和甲醇粗提物（TM）。活性分级物通过正相和反相快速色谱（flash chromatography）、半制备型高效液相色谱-二极管阵列检测-质谱联用（semi-preparative HPLC-DAD-MS）以及液相色谱-固相萃取-核磁共振（LC-SPE-NMR）进行纯化。化合物结构解析采用一维（1D）和二维（2D）核磁共振（NMR）结合高分辨电喷雾电离质谱（HR-ESI-MS）。生物活性评估包括：抗疟原虫活性（乳酸脱氢酶法，P. falciparum K1氯喹耐药株）、抗菌活性（微量稀释法，金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus ATCC 6538和白色念珠菌Candida albicans ATCC 59630）以及细胞毒性（MRC-5SV2人胎儿肺成纤维细胞）。

**研究结果**

**3.1 分离与鉴定**
通过多步纯化，从正己烷相、二氯甲烷相和甲醇相中分别获得5、8和6个化合物，共19个代谢物（1–19）。结构鉴定表明，这些化合物包括角鲨烯（squalene, 1）、环阿屯-24-烯-3β-基α-亚麻酸酯（cycloart-24-en-3β-yl α-linolenate, 2）、α-生育酚（α-tocopherol, 3）、反式-五甲基-二十碳四烯（trans-pentamethyl-icosa-tetraene, 4）、3-β-羟基-齐墩果-12-烯-十七烷酸酯（3-β-hydroxy-olean-12-ene-heptadecanoate, 5）、植醇（phytol, 6）、异植醇（isophytol, 7）、(1,2)-bis-nor-phytone（8）、脱镁叶绿素-a甲酯（pheophorbide-a methyl ester, 9）、脱镁叶绿素-b甲酯（pheophorbide-b methyl ester, 10）、豆甾-5-烯-3-O-β-葡萄糖苷（stigma-5-en-3-O-β-glucoside, 11）、香草酸（vanillic acid, 12）、脱落酸（abscisic acid, 13）、没食子酸（gallic acid, 14）、杨梅素-3-O-鼠李糖吡喃糖苷（myricetin-3-O-rhamnopyranoside, 15）、槲皮素-3-O-鼠李糖吡喃糖苷（quercetin-3-O-rhamnopyranoside, 16）、杨梅素-3′,5′-二甲醚-3-O-半乳糖吡喃糖苷（myricetin-3′,5′-dimethylether-3-O-galactopyranoside, 17）、槲皮素-3-O-β-D-半乳糖吡喃糖苷（quercetin-3-O-β-D-galactopyranoside, 18）和表儿茶素-3-没食子酸酯（epicatechin-3-galloyl ester, 19）。除没食子酸外，所有化合物均为首次从T. alnifolia中报道。

**3.2 抗疟原虫活性**
通过抗疟原虫活性测试，最强活性化合物为脱镁叶绿素-b甲酯（IC₅₀ = 1.0 ± 0.7 μM）、(1,2)-bis-nor-phytone（IC₅₀ = 2.0 μM）、异植醇（IC₅₀ = 4.0 μM）、脱镁叶绿素-a甲酯（IC₅₀ = 2.8 ± 1.2 μM）、表儿茶素-3-没食子酸酯（IC₅₀ = 5.5 ± 2.1 μM）和植醇（IC₅₀ = 6.9 ± 2.4 μM）。杨梅素-3-O-鼠李糖吡喃糖苷（IC₅₀ = 14.3 μM）、α-生育酚（IC₅₀ = 13.5 μM）和环阿屯-24-烯-3β-基α-亚麻酸酯（IC₅₀ = 25.0 μM）活性较弱，其余化合物无活性。结构-活性关系分析显示：脱镁叶绿素类化合物中，C-13位羟基化与C-17位羧酸酯化可增强活性；C-7位醛基取代（如脱镁叶绿素-b甲酯）显著提高抗疟活性但增加细胞毒性。植醇及其衍生物中，双键位置和氧化程度影响活性，异植醇（双键移位）和(1,2)-bis-nor-phytone（进一步氧化及碳链缩短）活性依次增强。酚类化合物中，B环C-5′位羟基（如杨梅素-3-O-鼠李糖苷）和没食子酰基的存在对活性至关重要。

**3.3 抗菌活性**
抗菌活性测试显示，仅没食子酸（14）对金黄色葡萄球菌（S. aureus）表现出微弱活性（IC₅₀ = 32.46 μM），其余化合物对S. aureus和白色念珠菌均无活性（IC₅₀ > 64 μM）。该结果与文献报道的部分化合物（如杨梅素-3-O-鼠李糖苷、植醇）的抗菌活性不一致，可能因测试菌株或方法差异所致。

**讨论与结论**

本研究通过生物活性指导分离，系统鉴定了T. alnifolia叶片中的抗疟原虫活性成分。研究人员发现，脱镁叶绿素衍生物和植醇衍生物是主要的抗疟活性贡献者，但其细胞毒性（尤其是脱镁叶绿素-b甲酯，CC₅₀ = 0.7 μM）限制了治疗指数。相比之下，表儿茶素-3-没食子酸酯（选择性指数>11.6）和异植醇（CC₅₀ > 64 μM）表现出较好的选择性。该研究为T. alnifolia的传统抗疟用途提供了化学依据，并揭示了叶绿素降解产物和植醇代谢物作为抗疟先导化合物的潜力。论文结论部分指出：本研究为T. alnifolia在治疗感染性疾病（尤其是疟疾）中的传统应用提供了实验支持。通过生物活性指导，研究人员从叶片中分离并鉴定了活性成分，从而证实了其民族药理学基础。正己烷、二氯甲烷和甲醇提取物具有抗疟原虫活性，随后的分级分离获得19个代谢物，其中大部分为首次报道。最强抗疟原虫活性见于脱镁叶绿素-b甲酯、(1,2)-bis-nor-phytone、异植醇、脱镁叶绿素-a甲酯和植醇。相比之下，杨梅素-3-O-鼠李糖苷、α-生育酚和环阿屯-24-烯-3β-基α-亚麻酸酯活性较低。值得注意的是，脱镁叶绿素-b甲酯、脱镁叶绿素-a甲酯和植醇也表现出显著细胞毒性。这些发现有助于加深对T. alnifolia叶片提取物抗疟原虫活性的理解。