《Advanced Science》：Deep Volumetric Super-Resolution Imaging in Thick Biological Specimens With Sparse Scanning SIM
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这篇论文报告了一种用于厚生物样本深层成像的稀疏扫描结构光照明显微术(SS-SIM)。该方法将快速激光束扫描与像素寻址的强度调制及sCMOS检测相结合，能实现约150 nm的空间分辨率，在整个可用成像深度（受限于物镜工作距离，可达300/600 μm）内，其横向和轴向分辨率分别比宽场显微镜提高了1.6/1.7倍。SS-SIM兼具单光子(1PE)与双光子(2PE)激发能力，其简单、鲁棒和高性能的特点，为厚组织、类器官和小型生物体等复杂生物环境下的高对比度三维可视化提供了实用方案。
引言
高分辨率荧光显微成像对于探索生物结构、动力学和功能至关重要，但传统远场成像受阿贝衍射极限限制。结构光照明显微术(SIM)作为一种快速超分辨率成像技术，因其适用性广和光毒性低而受到青睐，但其对散射的敏感性限制了在厚样本中的体积成像应用。为解决这一挑战，本文提出了一种新型的稀疏扫描结构光照明显微术(SS-SIM)。
SS-SIM显微镜概述与结构光照
SS-SIM系统基于一个自建荧光显微镜平台，集成了水浸物镜、脉冲激光器（用于1PE和2PE）和宽场sCMOS相机。其核心原理是通过快速共振扫描镜(RM)和电流计反射镜(GM)对激光焦点进行扫描，并同步调制激光强度，从而在单个相机帧的积分时间内生成焦平面上的任意二维激发图案。
与使用密集干涉条纹的传统SIM不同，SS-SIM采用条纹间距为2.4 μm的稀疏条纹图案。模拟和实验均表明，较大的条纹间距能有效保持高条纹对比度，从而在更长的轴向范围内维持高质量的成像。这种设计赋予了SS-SIM优于传统SIM的八倍更短的轴向扩展和光学切片能力，这是其实现深层成像的关键。
超分辨率图像采集与重建
SS-SIM的成像流程包括采集一组具有不同相移和方向的原始图像。为追求快速成像，本文采用了正交照明图案方案，在每个横向维度上采集12幅相移条纹图案。因此，一次SS-SIM重建总共需要采集24幅原始图像，耗时仅0.65秒，比传统的单点扫描SIM快一个数量级。
稀疏条纹图案的周期剖面包含五个显著高于噪声的空间谐波。通过类似于非线性SIM的图像重建算法，可以将这些高频信息移入系统的衍射极限通带，最终实现相对于标准宽场(WF)成像约1.6倍的空间分辨率提升。对固定在盖玻片上的40纳米荧光微球的成像实验证实，SS-SIM的横向分辨率（FWHM）达到154±12纳米，而WF为246±12纳米，分辨率提升因子恰好为1.6。
仿体样本的超分辨体积成像
为了验证SS-SIM的深层成像能力，研究团队将荧光微球嵌入琼脂糖凝胶中制备了三维仿体样本。使用长工作距离物镜，在轴向600 μm的深度范围内以400 nm为步长采集图像。
结果显示，在整个轴向范围内，SS-SIM的图像清晰度显著优于WF和线共聚焦成像。定量分析表明，SS-SIM相对于WF和线共聚焦，平均分别实现了1.5倍和1.3倍的横向分辨率增强、1.7倍和1.4倍的轴向分辨率增强，并且信背比(SBR)分别提升了8.6倍和3.6倍。这充分证明单光子SS-SIM能够在高达600 μm的轴向范围内实现深层三维超分辨率成像。
COS-7细胞中亚细胞器成像
接下来，研究应用SS-SIM对培养的COS-7细胞（猿猴成纤维样细胞系）的亚细胞结构进行成像。通过免疫标记线粒体外膜蛋白Tom20和微管蛋白α-tubulin，分别对线粒体和微管进行成像。
SS-SIM图像在线粒体和微管的成像中均展现出比WF更高的分辨率和图像对比度。例如，在微管成像中，SS-SIM模式的FWHM为171±6纳米，而WF为275±14纳米，实现了1.6倍的分辨率提升，且信背比提高了五倍。SS-SIM能够清晰分辨WF图像中无法区分的三条紧密排列的微管，进一步证明了其卓越的解析能力。
斑马鱼幼体的体积成像
斑马鱼幼体被用作厚组织样本，以测试SS-SIM的深层组织成像能力。使用STAR RED-鬼笔环肽标记肌动蛋白丝(F-actin)，对斑马鱼尾部肌肉和眼部虹膜区域进行三维成像。
在尾部肌肉区域，WF图像中肌纤维分辨率差且背景噪声高，而SS-SIM图像背景几乎被完全抑制，能够清晰显示肌纤维的横纹结构。在眼部，SS-SIM成功揭示了负责瞳孔扩张的虹膜放射状瞳孔开大肌纤维的详细结构。与标准共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)相比，SS-SIM在达到相似穿透深度和信背比的同时，获得了1.6倍的横向分辨率提升，且图像采集速度快了67倍。
双光子荧光激发的体积成像
双光子激发(2PE)显微术因其固有的光学切片能力、减少的光漂白和更深的组织穿透深度，成为深层组织成像的优异模态。研究团队在SS-SIM系统中集成了920纳米飞秒脉冲激光作为2PE激发源。
对琼脂糖凝胶中荧光微球的成像实验表明，2PE SS-SIM在整个深度范围内均提供显著优于WF和线共聚焦的图像质量，平均分别实现1.5倍和1.2倍的横向分辨率增强、1.8倍和1.2倍的轴向分辨率增强，以及4.3倍和7.5倍的信背比提升。此外，研究还将2PE SS-SIM应用于表达绿色荧光蛋白(GFP)家族荧光蛋白的转基因动物组织样本，包括斑马鱼运动神经元、小鼠肾脏和脑切片。在所有样本中，SS-SIM图像均显示出优于线共聚焦图像的信背比和空间分辨率。对表达Thy1-EGFP融合蛋白的小鼠脑组织（经透明化处理）的成像，成功清晰地显示了神经元网络中的细胞体、轴突和树突等精细结构。
讨论
本研究表明，SS-SIM能够在厚样本深处实现高对比度和高空间分辨率（横向和轴向）的荧光成像。其光学设计概念简洁，结合了快速聚焦激光束扫描、像素寻址强度调制和同步sCMOS检测。得益于这种简单性，SS-SIM可以仅通过适度修改即可集成到现有的共聚焦显微镜平台中。
目前SS-SIM的实现使用了包含五个谐波的周期性条纹图案，实现了相对于衍射极限约1.6倍横向和1.7倍轴向的分辨率提升。使用高度聚焦的光进行结构照明赋予了该方法优异的光学切片能力。未来的改进方向包括：使用二维晶格图案（如正交或三角晶格）替代一维条纹，以减少原始图像数量，从而加速数据采集；采用随深度增加而增大的可变条纹周期方案，以平衡成像速度与信噪比；集成自适应光学以补偿系统和样本引起的像差，进一步提升在厚且强散射样本中的成像性能。
与线扫描SIM、多线正交扫描时间聚焦(mosTF)显微术、双光子即时SIM(2P ISIM)和多共聚焦ISM(MC-ISM)等其他高速深层组织成像模态相比，SS-SIM因其采用紧聚焦照明生成的稀疏条纹图案而在成像深度上表现优异，其高成像速度则主要源于与激光强度调制同步的快速共振光束扫描。
结论
总而言之，SS-SIM为使用单光子或双光子激发的深层组织荧光成像提供了显著优势。凭借其概念上的简洁性，SS-SIM有望成为对组织、类器官和模式生物（包括活体样本）进行高分辨率成像的通用工具。
