基于对接引导和磷酸模拟理性工程的方法，对来自Trichoderma reesei的葡萄糖不敏感的木糖转运蛋白进行改造

《Microbial Cell Factories》：Docking-guided and phosphomimetic rational engineering of glucose-insensitive xylose transporters from Trichoderma reesei

本研究通过基因改良和计算模型筛选出低葡萄糖亲和力、高木糖转运效率的Trichoderma reesei转运蛋白，验证了磷酸化修饰对转运蛋白功能的影响，为提高生物精炼中乙醇共发酵效率提供了理论依据。

　　

摘要

背景

通过改造酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）以利用木糖，是提高通过戊糖发酵生产第二代乙醇（2G）的发酵效率的关键。为此，主要策略之一是表达异源木糖转运蛋白，以确保这种糖的有效吸收。然而，由于糖转运蛋白本身的非特异性，不同糖类（如木糖和葡萄糖）之间会存在竞争，从而导致戊糖转运效率降低，乙醇产量减少。本研究旨在通过遗传改良Trichoderma reesei的转运蛋白，并将其异源表达在S. cerevisiae中，从而开发出对葡萄糖亲和力较低但仍能转运木糖的转运蛋白。为此，研究人员对比了已知对木糖转运重要的基序，并预测了可能具有磷酸化位点的位置。基于这些预测，对转运蛋白进行了建模，并将其与葡萄糖和木糖进行了对接分析。具有所需表型的转运蛋白在S. cerevisiae菌株中表达并进行表征。通过滴定实验和好氧发酵试验验证了预测的结果。计算机模拟分析显示，Str3（Tr62380）中的两个突变表现出良好的表型。对于尚未进行表征的Tr82309，决定先对其野生型转运蛋白进行表征。

结果

滴定实验显示，所测试的转运蛋白在生长表型上存在显著差异。对接分析仅作为一种定性的、用于生成假设的工具，用于优先选择进行实验测试的突变，并不用于预测转运动力学或底物亲和力。Str3（Tr62380）的突变体确实失去了对己糖的天然亲和力。此外，Tr82309在液体培养基中的活性有限，但在固体培养基中较高浓度的木糖条件下仍能支持生长，这表明其功能可能依赖于具体条件，而非具有确定的底物特异性。在好氧发酵实验中，只有Str3（Tr62380）_WT菌株表现出从培养基中高效吸收糖的能力；而插入Str3（Tr62380）中的突变降低了其转运糖的能力，尤其是葡萄糖的能力。磷酸化模拟实验证明了翻译后修饰可以影响糖转运蛋白的底物利用特性。

结论

对接分析作为一种定性筛选步骤，有助于指导实验验证所需的突变选择。我们还提出了磷酸化位点作为糖转运蛋白工程研究的新目标。然而，实验验证是必不可少的。总之，我们的发现为开发对葡萄糖不敏感的木糖转运蛋白提供了合理的框架，从而提高了生物精炼厂中糖的共发酵效率。