《BMC Genomics》：Functional characterization of 2,3-oxidosqualene cyclase8 in Taraxacum mongolicum: overexpression enhances taraxasterol biosynthesis and antioxidant capacity
引言
蒲公英（Taraxacum mongolicum）是一种广泛分布于中国的菊科多年生草本植物，在传统医药中备受重视，因其具有多种具有显著生物活性的次生代谢物。这些代谢物不仅赋予其药用特性，还在环境适应和防御中发挥关键作用。蒲公英甾醇（Taraxasterol）是一种五环三萜类化合物，分子式为C30H50O，其分子结构与含有环戊烷和多氢菲的甾体激素高度相似。研究表明，蒲公英甾醇具有抗炎、抗氧化和抗肿瘤等药理学特性。例如，它可通过激活核因子E2相关因子2（Nrf2）信号通路增强细胞抗氧化能力，并调节凋亡和自噬相关基因的表达，从而缓解黄曲霉毒素B1诱导的肝损伤。此外，蒲公英甾醇还能通过上调组氨酸三联体核苷酸结合蛋白（HINT）的表达来抑制肝细胞癌的生长。由于其重要的药用价值和天然丰度较低，研究植物特异性三萜类化合物的生物合成与代谢工程变得日益重要。
2,3-氧化角鲨烯环化酶（OSC）是三萜代谢途径中的关键酶，它催化形成多种三萜骨架，这些骨架可被进一步修饰形成广泛的生物活性三萜。OSC在甾醇合成途径中扮演重要角色，因此，通过调控氧化角鲨烯环化酶的活性和表达水平，可以有效调节甾醇的合成产量和类型。尽管OSC基因家族已在许多植物中得到初步研究，但蒲公英中OSC（TmOSC）基因家族在蒲公英甾醇生物合成途径中的具体作用尚未完全阐明。环境胁迫（如盐胁迫、干旱胁迫、机械损伤和病原体感染）会触发这些代谢物的积累。其中，茉莉酸甲酯（MeJA）已被证明可诱导多种植物次生代谢物的积累，例如能增加蒲公英根悬浮细胞中蒲公英甾醇的含量。然而，TmOSC基因与MeJA诱导的蒲公英甾醇合成之间的联系尚不清楚。
方法
本研究采用了包括生物信息学分析、基因表达谱分析、分子生物学技术以及生理生化测定在内的一系列技术。通过挖掘蒲公英基因组数据，旨在鉴定TmOSC基因家族成员，分析其特性和保守基序，并通过转录组测序和定量实时聚合酶链反应（qRT?PCR）解码它们在组织间以及非生物胁迫下的表达模式。还将通过基因过表达来验证TmOSCs对蒲公英甾醇合成和胁迫抗性的影响。
植物材料和激素处理方面，实验使用了石河子大学生命科学学院提供的蒲公英植株和种子。在实验室中，植株在温室中培养三个月。生长均匀的蒲公英植株在霍格兰氏液中预培养2天，然后分别用500 μM MeJA或100 μM ABA处理，并选择0、3、6、12和24小时五个时间点，每组进行三次生物学重复。本氏烟草用于亚细胞定位分析。
TmOSC基因家族鉴定中，首先获取了最新的蒲公英参考基因组信息。使用AtOSC蛋白作为查询序列，对蒲公英基因组进行BLASTP搜索以获取OSC蛋白序列。同时，从Pfam数据库下载了OSC蛋白的隐马尔可夫模型（HMMs）PF13243和PF13249，并使用Hmm-search工具筛选整个蒲公英蛋白质组。通过NCBI-CDD、InterProScan和SMART验证结构域完整性，最终获得TmOSC基因家族成员。使用ExPaSy和WoLF PSORT预测OSC蛋白的分子量（MW）和等电点（pI），并通过Cell-PLoc 2.0工具分析TmOSC蛋白的亚细胞定位。通过SOPMA服务器预测和分析TmOSC蛋白的二级结构，并通过同源建模和SWISS-MODEL预测蛋白质的三维结构。
在TmOSC蛋白及其基因结构、保守结构域和系统发育分析中，通过MEME表征了TmOSC蛋白的基序组成和分布。通过SignalP-6.0预测TmOSC蛋白的信号肽和跨膜结构域。为探索进化关系，通过Clustal W软件对从筛选中获得的不同物种的OSC蛋白进行了多重序列比对，然后通过MEGA version 11软件使用最大似然估计（ML）方法构建了系统发育树。
在OSC基因的共线性分析和TmOSC基因的启动子分析中，使用TBtools软件检索了蒲公英及其近缘物种的OSC基因ID文件，随后使用基因定位可视化插件对每个物种中的OSC基因进行可视化染色体定位。通过MCScanX分析这些物种间OSC基因的共线性。从蒲公英参考基因组中截取起始密码子（ATG）上游2000 bp的区域，并通过在线工具PlantCARE预测启动子区域的顺式作用元件。
在TmOSCs的过表达和亚细胞定位中，从蒲公英中分离出的目标基因（TmOSC3、TmOSC8和TmOSC10）的全长编码序列（CDS）使用含有SmaⅠ和SalⅠ酶切位点的基因特异性引物通过PCR扩增。将扩增的片段插入pCAMBIA1300-GFP载体中，构建TmOSC-eGFP融合表达载体，并通过菌落PCR和桑格测序验证。将验证后的重组载体通过冻融法转化到根癌农杆菌GV3101中，用于后续的蒲公英感染实验。为了进行瞬时过表达测试，按照上述方法重组并转化了去除终止密码子的CDS序列。
在RNA分离和相关基因表达分析中，使用TRIzol试剂从样品中提取总RNA用于qRT?PCR。使用FastQuant第一链cDNA合成试剂盒进行cDNA合成。使用LightCycler 480实时PCR系统、qPCR试剂盒和Roche LightCycler仪器进行qRT?PCR。每个处理使用三个生物学重复。qRT?PCR引物设计使用Prime5软件，以TmACTIN作为内参基因，并使用2?ΔΔCt方法分析数据。
在RNA-Seq分析和植物生理指标测定中，从NCBI的公开数据中获取了蒲公英叶、根和花的原始RNA测序数据以及不同时间段ABA处理的RNA原始测序数据。通过SRA Toolkit v2.9将原始数据转换为fastq格式。随后，使用Trimmomatic-0.39对原始读数进行质量修剪。质量检查后，使用StringTie v2.1.3将clean reads比对到蒲公英参考基因组以计算基因表达水平。使用生理指标测定试剂盒测定过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）、丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）。使用二氨基联苯胺（DAB）和氮蓝四唑氯化物（NBT）溶液对蒲公英幼叶切片进行ROS的组织化学染色。
在总三萜和蒲公英甾醇的提取和含量分析方法中，总三萜含量通过铁硫氰酸酯比色试剂测定。蒲公英甾醇的分析根据高效液相色谱（HPLC）标准方案进行。
结果
蒲公英中TmOSC基因家族成员的鉴定与分类
通过AtOSC蛋白序列比对、基于基序的筛选和转录本去重，我们在蒲公英基因组中鉴定出10个OSC家族成员。根据OSC基因在染色体上的定位顺序，命名为TmOSC1-TmOSC10。TmOSCs分布在八条染色体中的三条上（Chr3、Chr7和Chr8），大多数成员位于Chr7基因簇，TmOSC1位于Chr3基因簇，而TmOSC10分布在Chr8基因簇。我们预测并分析了TmOSC蛋白的结构，成员的二级结构以α-螺旋结构为主，占总量的42.66%至48.11%。蛋白质三级结构的多样性源于二级结构的不同组合，TmOSC7和TmOSC8蛋白在空间折叠形成的构象上具有高度相似性。跨膜结构域分析的预测结果显示，TmOSC3和TmOSC6蛋白中各有一个跨膜结构域，而其余蛋白没有跨膜结构。随后分析了每个TmOSC成员的理化性质，包括蛋白质序列的等电点、分子量、氨基酸数量、开放阅读框长度和稳定性常数。TmOSCs的分子量范围从69.46 kDa到92.80 kDa，氨基酸数量从607个（TmOSC2）到804个（TmOSC5）不等。开放阅读框全长从1824 bp（TmOSC2）到2415 bp（TmOSC5）不等。此外，TmOSC成员的等电点范围在5.54（TmOSC7）到6.37（TmOSC5）之间，所有成员均为酸性蛋白（pI < 7）。其中四个蛋白（TmOSC1、TmOSC4、TmOSC5和TmOSC8）更稳定，不稳定指数< 40.0。对家族成员脂质指数的预测显示，TmOSC蛋白高度稳定，TmOSC1的脂质指数最高为83.4，TmOSC2最低为73.79。TmOSC家族成员的总平均亲水性（GRAVY）均小于0，表明TmOSC蛋白是亲水性的。亚细胞定位预测显示，所有蛋白均定位于细胞质。
蒲公英TmOSC基因保守基序、结构域及基因结构分析
蛋白质结构分析显示，TmOSCs总共包含三个亚组。TmOSC2、3、4和5属于同一亚组，但TmOSC2缺少基序10，TmOSC3缺少基序5；TmOSC6、10、7和8属于同一亚组，三个基因中基序的分布位置大致相似，但TmOSC6仍然缺少基序10。TmOSC1和TmOSC9属于同一亚组，且TmOSC1中有两个基序6。保守基序表明，除基序10和基序5外，所有TmOSCs均包含八个基序。TmOSCs的外显子数量在13到20个之间，SQHop_cyclase_C和/或SQHop_cyclase_N结构域的固定外显子数量表明TmOSCs的蛋白质结构是保守的。大多数TmOSC结构域包含3-8-6-5基序和7-2-1-9-4基序，这些基序在基序分析中显示出高度一致性。
为了探索TmOSC蛋白的进化过程，我们对氨基酸序列进行了比对，重点关注三个高度保守的序列：QXXXXXW基序、DCT(A/G)E基序和MWC(Y/H)CR基序。比对分析显示，TmOSC成员包含3到5个高度保守的重复QXXXXXW基序。
TmOSC蛋白的系统发育分析
为了阐明不同植物物种中OSC蛋白的进化关系，我们构建了一个包含蒲公英和几种参考生物的系统发育树：模式植物（水稻、本氏烟草、拟南芥）和密切相关的菊科物种（莴苣、向日葵、橡胶草）。基于序列相似性和系统发育分析，OSC蛋白主要分为四个主要分支，进化分支1至4中分别有26、31、12和20个蛋白。TmOSC1聚集在分支1，TmOSC9聚集在分支2，TmOSC2、TmOSC3、TmOSC4和TmOSC5集中在分支3，而TmOSC6、TmOSC7、TmOSC8和TmOSC10集中在分支4。OsOSCs全部聚集在分支1，而大多数AtOSC蛋白分布在分支3，表明进化关系更为保守。相比之下，来自莴苣、向日葵和橡胶草（与蒲公英亲缘关系更近的物种）的OSC蛋白与TmOSCs分组更紧密，表明它们的OSC蛋白之间的种间进化关系更近。对蒲公英和已发表的非菊科物种OSC基因家族成员的系统发育分析揭示了一个五分支的系统发育树。物种特异性保守性很明显：大多数小麦OSC聚集在分支4，而TmOSC主要占据分支3。这些结果表明，TmOSC与菊科以外家族的OSC表现出更大的进化距离，突出了菊科内谱系特异性的多样化。
TmOSC基因的共线性分析
为了评估蒲公英及其菊科近缘物种中协同分布的关系，我们分析了不同物种中OSC基因家族的染色体定位分布及其进化关系。结果显示，OSC在各染色体上的分布不均匀，在二倍体蒲公英中，TmOSC分布在三条染色体上：Chr3、Chr7和Chr8。此外，在水稻等物种中，OSC基因分布在三条或更多染色体上。蒲公英与橡胶草呈现三对共线性OSC基因，与莴苣、向日葵和艾草分别呈现四、三和五个共线性基因，并且所有四个物种都与TmOSC1和TmOSC10呈现共线性。
TmOSC基因家族顺式作用元件分析
启动子顺式作用元件是重要的转录起始结合区域，在基因表达的调控中发挥重要作用。在10个TmOSC基因启动子上游2000 bp区域中鉴定出多类顺式作用元件。这些元件分为五大类：光响应、激素响应、环境响应、发育相关和启动子相关结合位点。其中，启动子相关结合位点占比最大（占所有元件的47.68%），环境因素占10.98%，激素响应位点占13.72%，且激素响应元件占比较大。所有家族成员中的大多数基因都含有脱落酸（ABA）响应元件（ABRE、ABRE3a和ABRE4），以及茉莉酸甲酯（MeJA）响应元件（TGACG-motif和CGTCA-motif），而TmOSC6和TmOSC8不含ABA响应元件，只有TmOSC1、TmOSC2、TmOSC4和TmOSC6含有MeJA响应元件。环境响应元件ARE存在于几个OSC基因家族成员中，在抗氧化防御机制中起关键作用。这些结果表明，TmOSC家族成员可能在植物生长和代谢调控中发挥作用。
TmOSC表达的亚细胞定位
为了进一步探索TmOSC蛋白在细胞中的表达，通过蒲公英转录组数据分析初步确定了三个潜在的关键候选基因用于后续瞬时表达试验。然后我们进行了亚细胞定位以验证蛋白质发挥功能的具体位置。将TmOSC基因通过去除终止子的引物连接到pCAMBIA1300-eGFP载体上，然后与细胞质标记物共感染并在本氏烟草中瞬时表达。TmOSC-pCAMBIA1300-eGFP融合蛋白的绿色荧光与合并区域的细胞质标记物的红色荧光表明，TmOSC3、TmOSC8和TmOSC10位于细胞质并分布在细胞核中，这与先前亚细胞定位预测的结果一致。
TmOSC基因表达模式及生理指标分析
为了进一步探索TmOSC基因的功能，我们用MeJA处理蒲公英，并设计引物通过qRT?PCR检测蒲公英根组织中OSC基因的表达。结果显示，在MeJA诱导后，TmOSC3、TmOSC4、TmOSC5、TmOSC6、TmOSC7、TmOSC8和TmOSC9在根系中的表达显著上调，其中TmOSC3是上调最显著的基因，推测其在MeJA调控通路中起关键作用。外源激素的添加不同程度地激活了这些基因的表达，而TmOSC1、TmOSC2和TmOSC10则逐渐下调，均在12小时达到最低值，随后趋于受调控。根据相关研究，在500 μM MeJA处理后对蒲公英中蒲公英甾醇的鉴定和定量显示，蒲公英甾醇浓度在3小时和6小时达到较高值，随后含量逐渐下降，这与总甾醇含量的变化一致。有趣的是，TmOSC3、TmOSC4、TmOSC6、TmOSC8和TmOSC10基因在3小时表达量最大，而TmOSC5和TmOSC9基因在6小时表达量最大。转录组数据比较显示，在蒲公英叶、根和花中，TmOSC8和TmOSC10的表达量显著高于其他基因。这些结果表明，这些基因参与了MeJA代谢的调控通路，并在特定组织中调控生长发育过程。
为了研究MeJA处理下蒲公英细胞损伤程度和抗氧化防御系统的激活情况，我们测定了蒲公英根和叶在不同处理组织中的CAT、MDA、POD和SOD含量。结果显示，在MeJA处理下，蒲公英根中的CAT和SOD活性在12小时达到峰值，MDA和POD的表达在24小时达到峰值，所有四个生理指标均呈现先下降后上升的趋势。有趣的是，MeJA处理下叶片中CAT、POD和SOD含量的变化与根中观察到的趋势一致。
此外，我们用ABA处理蒲公英根组织，并检测了TmOSC基因表达，结果显示大多数家族成员被ABA诱导显著上调。根系中TmOSC3和TmOSC4的上调幅度更大，这与转录组数据一致。有趣的是，根中TmOSC1、TmOSC2、TmOSC6、TmOSC7、TmOSC8和TmOSC10的表达水平均呈现先下降后上升，但在24小时再次下降的模式，其中在3小时观察到最低表达。此外，蒲公英根中的总甾醇含量在3小时达到最低值，仅为5 mg/g。为了评估ABA处理的蒲公英细胞损伤，分析了抗氧化酶活性和脂质过氧化。CAT活性随着ABA处理时间的延长而逐渐降低，但在24小时恢复。POD活性先下降后上升，与TmOSC基因表达的趋势一致。SOD活性在6小时达到峰值，与其他时间点相比，在0小时时无明显变化。MDA含量在3小时急剧增加后下降，表明存在短暂的膜损伤随后修复。ABA处理下叶片中CAT、POD和SOD含量的变化与根中表达的一致，表明TmOSC家族成员在一定程度上参与了ABA代谢通路的调控。总之，TmOSC3、TmOSC8和TmOSC10这三个基因可能作为关键靶点，并对蒲公英甾醇的合成产生影响。
过表达TmOSC8基因促进蒲公英中蒲公英甾醇积累
MeJA诱导可促进蒲公英中三萜类化合物的积累，表明MeJA可能通过激活相关信号通路来调控三萜类生物合成。由于OSC是甾醇生物合成中的限速酶，并且基于其根系高表达、与环阿屯醇合酶的高度同源性以及保守的DCTAE基序，我们推测TmOSC8可能在蒲公英的甾醇生物合成途径中起关键调节作用，其环化作用使萜类化合物多样化。为了阐明TmOSC8是否影响蒲公英甾醇的产生，选择了三个独立的TmOSC8过表达株系进行进一步研究。qRT?PCR测定结果显示，转基因株系根中TmOSC8基因的转录水平显著高于对照组。与野生型株系相比，OE2和OE16株系的TmOSC8基因转录水平增加了约20倍。与对照相比，OE7株系的TmOSC8基因转录水平增加了高达60倍，并且蒲公英甾醇含量从0.032 mg/g增加到0.118 mg/g，是对照组的3.68倍。
为了研究过表达TmOSC8基因对蒲公英造成的抗氧化损伤程度，我们测定了OE2、OE7和OE16过表达株系根中的CAT、MDA、POD和SOD含量，结果显示，三种酶（CAT、POD和SOD）的含量均显著高于对照，而MDA含量显著低于对照。为了研究过表达TmOSC8是否能在一定程度上消除ROS，我们使用了DAB和NBT染色，结果显示过表达株系幼叶中的染色密度显著低于野生型株系，表明过表达TmOSC8可以消除植物体内的ROS。这些生理指标在一定程度上表明，过表达TmOSC8基因后，蒲公英的细胞抗氧化能力有所增强。
讨论
蒲公英因其丰富的药用和食用价值，在植物学和药理学领域备受关注。其生物学特性和次生代谢物生物合成途径，尤其是萜类合成网络，已成为当前研究的核心方向。本研究重点对蒲公英中TmOSC基因家族成员进行了全基因组鉴定和序列表征，旨在揭示该家族成员响应ABA和MeJA处理的调控机制，并为分析甾醇合成途径提供新视角。OSC在植物萜类化合物的生物合成中起着关键作用，催化角鲨烯氧化转化为多种萜类化合物，包括甾醇、三萜和倍半萜。蒲公英中OSC基因家族成员可能通过成员间的功能分化参与不同萜类化合物的生物合成。本研究通过全基因组分析，共鉴定出10个OSC基因家族成员。序列分析显示，所有成员都具有OSC家族典型的保守基序。这些包括参与底物结合和质子化的DCTAE基序；决定底物折叠模式和产物类型的MWCYCR基序；以及影响酶稳定性和产物特征的QXXXXXW基序。OSC属于一个在植物中高度保守的酶超家族。其保守区域能够催化2,3-氧化角鲨烯的质子化、环化、重排和去质子化，形成各种三萜骨架。
在系统发育树中，蒲公英的OSC蛋白与菊科近缘物种（如莴苣和向日葵）的OSC蛋白紧密聚类，表明了三萜类生物合成中的共同祖先和共享的选择压力。这种保守性可能反映了代谢作用所必需的关键功能域。相反，与非菊科物种（拟南芥、小麦）的远距离聚类突出了由生态适应和代谢需求驱动的科特异性分化。值得注意的是，TmOSC缺乏组内共线性，表明存在频繁的染色体重排。然而，蒲公英与其他菊科物种之间OSC蛋白广泛的跨物种共变性表明，菊科植物可能在其协同进化分支上保留了保守的染色体片段或调控模块。这些遗传元件可能是维持OSC基因拷贝数和功能稳定性的关键决定因素。上述结果为解析TmOSC基因家族的进化轨迹及其功能分化机制提供了重要线索，特别是组内重排与科间保守的双重模式，可能构成了蒲公英适应环境胁迫和维持萜类合成多样性的关键进化策略。
启动子区域的顺式作用元件在调节植物生长、发育以及生物和非生物胁迫抗性方面起着关键作用。这些包括激素响应元件，如ABA、MeJA和乙烯响应元件，它们可能参与多种激素信号通路。转录组和表达谱的一致数据显示，在ABA胁迫下，TmOSC3是上调最显著的成员，而TmOSC8和TmOSC10在叶、根和花中的表达水平明显高于其他基因。它们不同的表达模式表明这些基因是参与胁迫响应的潜在关键候选基因，促使我们进一步研究它们的亚细胞功能定位。我们在不同时间点用MeJA处理蒲公英，发现根中TmOSC基因的表达动态变化，其中TmOSC3在3小时的表达量增加了10倍，TmOSC4同期增加了5倍，TmOSC9在6小时增加了7倍。值得注意的是，这些基因的启动子区域（2000 bp内）对MeJA有直接响应。元件的稀缺性表明，MeJA可能通过间接途径调节OSC基因表达，这可能涉及其他信号分子、转录因子或信号通路的介导，同样不排除转录后调控的可能性。这些发现与先前的报告一致，表明转录因子可以调节三萜类合成，暗示了植物次生代谢调控网络的复杂性。作为一种重要的植物信号分子，MeJA可以通过间接或直接途径调节OSC基因。MeJA改变了香蜂草次生代谢基因的表达，这与我们在蒲公英中的发现一致，即MeJA诱导了TmOSC的动态表达。MeJA处理还引发了蒲公英根的氧化胁迫，这通过MDA水平升高得到证明，这与其他物种中ROS介导的膜损伤报告一致。值得注意的是，蒲公英根中的MDA含量呈现先短暂增加后减少的趋势，这与抗氧化酶（CAT、POD和SOD）活性呈负相关。这种双相响应在水稻中也有发生，低水平MeJA激活防御通路，而高水平MeJA通过抑制抗氧化酶加剧氧化损伤。MDA的初始增加可能反映了未受控制的ROS产生，而随后的酶激活，以SOD作为第一道防线，缓解了胁迫，展示了蒲公英的适应性抗氧化网络。从机制上讲，鉴于TmOSC启动子中MeJA响应元件的稀缺性，MeJA可能结合细胞内受体间接调节OSC转录，可能通过转录因子或转录后调控。抗氧化酶的时间协调性，例如SOD的启动作用以及CAT和POD的协同作用，强调了植物对抗氧化胁迫的多层防御策略，平衡了ROS清除和代谢适应。这些发现加深了我们对MeJA在胁迫信号传导和三萜类生物合成调控中双重作用的理解。
三萜类化合物的生物合成始于甲羟戊酸途径产生异戊烯焦磷酸和二甲基烯丙基焦磷酸。其核心骨架的构建依赖于OSC催化的环化反应。迄今为止，已报道来自不同植物的152个OSC能够催化形成31种不同的三萜骨架。其中，β-香树脂醇合酶和羽扇豆醇合酶等是功能表征最广泛的亚型，主导了植物三萜的结构多样性。通过酵母异源表达，来自蒲公英的TcOSC1酶可催化生成多种三萜类化合物。通过RNA干扰技术实现了乳管特异性OSC的组织特异性下调，并成功培育出三萜含量降低的橡胶草植株，使天然橡胶中的三萜类化合物减少了约67%。作为一种从蒲公英中提取的具有强生理、药理和生物活性的天然产物，其含量极低，因此提高其含量具有重要意义。在过表达TaMYC2的转基因株系中，蒲公英中的蒲公英甾醇含量从0.08 mg/g显著增加到0.16 mg/g。在蒲公英根中500 μM MeJA胁迫下，发现蒲公英甾醇含量的变化与总甾醇含量的变化一致。先前研究表明，莴苣OSC合成五环三萜，并且这些三萜具有防御和抗炎活性。鉴于TmOSC与这些OSC在序列和结构上的同源性，我们推断TmOSC也在蒲公英中触发2,3-氧化角鲨烯的环化，生成保守的三萜骨架，这些骨架随后通过特化酶被进一步修饰成物种特异性的防御代谢物。因此，TmOSC可能在三萜生物合成中扮演核心角色，为蒲公英对抗生物胁迫提供了关键的代谢防御。本研究表明，过表达TmOSC8基因触发了植物的抗氧化防御系统。抗氧化酶（POD、SOD和CAT）显著增加，而ROS含量和MDA水平显著低于野生型。过表达TmOSC8基因与氧化角鲨烯催化转化的增强有关，这有助于蒲公英甾醇的积累。在本研究中，通过转录组分析和胁迫处理的联合筛选，确定了TmOSC3、TmOSC8和TmOSC10是蒲公英甾醇合成的核心成员，它们表达模式与激素响应的相关性为甾醇合成提供了潜在靶点。未来，我们需要结合酵母双杂交和代谢流分析，阐明MeJA调节OSC基因转录的信号中间体以及酶活性转录后修饰的实时调控机制。
基于这些发现，我们对TmOSC基因家族有了更全面的了解，并确定它不仅可能参与蒲公英甾醇的合成，还能响应多种生物和非生物胁迫。值得注意的是，本研究的大多数分析依赖于生物信息学预测；除了TmOSC8过表达与蒲公英甾醇积累之间的初步关联外，其他TmOSC家族成员的实际生物学功能尚未通过体外或体内功能实验验证，其预测功能有待确认。
结论
本研究全面分析了蒲公英的OSC基因家族，共鉴定出10个TmOSC家族成员。通过基因组学和生物信息学技术，还分析了TmOSC的基本理化性质、三维结构模型、系统发育、保守结构域、基因结构、染色体定位和顺式作用元件。对不同植物OSC蛋白的系统发育和同源性分析为蒲公英OSC基因家族的进化提供了参考。还分析了TmOSC基因在MeJA和ABA处理下的组织表达模式，蒲公英甾醇的增加与TmOSC8基因的过表达相关，表明其在蒲公英中的潜在作用。本研究为研究蒲公英OSC基因家族提供了有用信息，这些发现将有助于更好地理解OSC在药用植物中的生物学功能和分子机制，并为蒲公英的基因功能研究和遗传改良分子育种奠定初步基础。
