基于结构的发现：利用体外实验、结构-活性关系分析、计算机模拟（in silico）、对MCF-7细胞系的细胞毒性测试、DNA对接以及分子动力学（MD）模拟等方法，筛选出4-苯基-5-对甲氧基甲基-4H-1,2,4-三唑硫醚类化合物作为15-脂氧合酶抑制剂

《Bioorganic Chemistry》：Structure-guided discovery of 4-phenyl-5- p-tolyloxymethyl-4 H-1,2,4-triazole thioethers as 15-lipoxygenase inhibitors using integrated in vitro, structure-activity relationship, in silico, cytotoxicity towards MCF-7 cell line, DNA docking and MD simulation methods

15-LOX抑制剂设计：新型1,2,4-三唑硫醚衍生物（6a-h）合成后显示强抑制活性（IC50 0.53-3.67 μM），SAR表明高脂溶性增强活性，且对MCF-7细胞生长抑制及DNA结合实验支持其作为抗炎抗癌双效候选药物。

　　

迪巴·纳瓦兹（Deeba Nawaz）| 布什拉·巴希尔（Bushra Bashir）| 安巴尔·伊克巴尔（Ambar Iqbal）| 艾莎·莫门（Ayesha Momen）| 穆罕默德·阿什拉夫（Muhammad Ashraf）| 阿维纳什·卡卡达·阿肖克（Avinash Karkada Ashok）| 艾莎·阿扎尔（Ayesha Azhar）| 纳希德·里亚兹（Naheed Riaz）

巴基斯坦巴哈瓦尔普尔伊斯兰大学（The Islamia University of Bahawalpur）巴哈瓦尔普尔-乌尔-贾迪德校区（Baghdad-Ul-Jadeed Campus），邮编63100

摘要

15-脂氧合酶（15-LOX）由于其参与花生四烯酸的代谢，在治疗炎症性疾病和抑制恶性肿瘤方面已成为一个重要的靶点。为此，研究人员设计并合成了一系列新的15-LOX抑制剂——这些抑制剂属于4-苯基-5-p-甲氧基-4H-1,2,4-三唑（4-phenyl-5-p-tolyloxymethyl-4H-1,2,4-triazole）的烷基/芳基衍生物（6a-h），并对其进行靶酶抑制活性测试。合成过程首先将2-p-甲氧基乙酸（2-p-tolyloxyacetic acid）转化为相应的酯（1）、肼（2）、硫代半卡巴嗪（3）和4-苯基-5-p-甲氧基-4H-1,2,4-三唑-3-硫醇（4）。目标化合物6a-h是通过烷基/芳基卤化物（5a-h）与4在KOH存在下反应获得的。中间体和产物均通过先进的光谱技术进行了表征。实验数据显示，这些化合物具有显著的15-LOX抑制活性（IC₅₀范围为0.53±0.11至3.67±0.28 μM）。结构-活性关系（SAR）分析表明，亲脂性更强的化合物表现出更强的抑制效果。此外，这些化合物对血液单核细胞无毒性。其中化合物6g在MCF-7乳腺癌细胞株中的IC₅₀值为5.32 μM，其次是6f、6d和6b，其抑制效果优于槲皮素。药效学研究也证实了这些化合物的良好成药性。体外实验结果与体内数据一致。DNA对接分析显示这些化合物能够与NF-κB信号通路成分结合，提示它们可能在基因调控中发挥作用。总体而言，这类1,2,4-三唑硫醚化合物具有潜在的双重作用机制，有望用于治疗慢性炎症和癌症。

引言

脂氧合酶（LOXs，E.C. 1.13.11.12）是一类非血红素铁依赖性的双加氧酶，能够将分子氧引入多不饱和脂肪酸（PUFAs），生成多种生物活性脂质介质，这些介质参与多种病理生理过程，如炎症、免疫监视和肿瘤发生[1]、[2]。人类体内存在多种类型的LOX，例如5-LOX和12/15-LOX，它们可以在花生四烯酸（AA）的5位、12位或15位进行氧化，生成羟基过氧化物。人类5-LOX的催化位点与15-LOX具有相似的氨基酸结构[3]、[4]、[5]。特别值得关注的是15-LOX同酶系统（15-LOX-1和15-LOX-2），它们在花生四烯酸和亚油酸的氧化代谢中起核心作用，分别生成15-羟基二十四碳四烯酸（15(S-HpETE）和13-羟基十八碳二烯酸（13(S-HpODE）。这些羟基过氧化物进一步转化为15(S-HETE和13(S-HODE[3]、[6]、[7]、[8]。特别是13(S-HODE，已被证实与癌症的发生密切相关[9]、[10]、[11]。在乳腺癌研究中，15-LOX的作用既有保护作用也有促进作用[12]、[13]、[14]。该酶的调控机制复杂，涉及细胞因子网络（如IL-4和IL-13）、配体结合的激素受体、活性氮物种以及钙敏感的转位机制[15]。饮食中的PUFAs比例、氧化还原状态以及环加氧酶（COXs）的相互作用会进一步影响肿瘤微环境（TME）中15-LOX的表达和催化活性[16]、[17]。 13(S-HODE和15(S-HETE还作为细胞内第二信使发挥作用。在肿瘤发生阶段，13(S-HODE通过激活JAK/STAT6通路、表观遗传调控以及过氧化物酶体增殖激活受体-γ（PPAR-γ）参与肿瘤发生[18]。在肿瘤发展阶段，它们通过MAPK/ERK和PI3K/Akt通路诱导增殖和抗凋亡信号[18]。此外，13(S-HODE还能通过caspase-3/7诱导细胞凋亡[19]、[20]。这些通路突显了LOX代谢物在肿瘤发生和进展中的多重作用。在转移过程中，12(S-HETE调节的NF-κB信号通路促进了淋巴管侵袭[21]。13(S-HODE与15(S-HETE的比例变化会通过干扰E-钙粘蛋白（E-cadherin）的平衡促进EMT（细胞外基质）的形成，从而增强肿瘤的转移能力[22]。除了肿瘤细胞外，15-LOX相关的信号通路还影响肿瘤微环境（TME），例如髓源性抑制细胞（MDSCs）中CREB（cAMP反应元件结合蛋白）的激活可促进肿瘤的免疫逃逸和转移[23]、[24]。综上所述，15-LOX代谢物在乳腺癌的起始、进展和转移过程中起着关键作用。

化学

在本研究中，按照方案1描述的方法合成了一系列新的1,2,4-三唑硫醚（6a-h）。化合物6a（3-乙基硫代-4-苯基-5-p-甲氧基-4H-1,2,4-三唑）以白色无定形固体形式获得，产率为93%（熔点：100-103°C）。其官能团通过红外光谱（IR）得到确认，特征吸收峰位于3028（Ar-H）、2931-2870（C-H）、1617-1563（Ar-C=C, C=N）和1167-1115（C-O, C-N, C-S）波长。1^H-NMR谱也证实了其烷基结构。

总体讨论

本研究成功设计并评估了一系列新型4-苯基-5-p-甲氧基-4H-1,2,4-三唑硫醚作为强效的15-LOX抑制剂。所有衍生物（6a-h）均表现出显著的15-LOX抑制活性，IC??值处于微摩尔级别，优于巴卡林（baicalein）和槲皮素（表2，图3）。其中化合物6d、6f、6g和6h的抑制效果最为显著，这可能与它们的疏水性有关。

结论

本研究设计并合成了一系列具有强效15-LOX抑制活性的4-苯基-5-p-甲氧基-4H-1,2,4-三唑硫醚衍生物，并对其进行了生物活性评估。所有合成化合物的IC₅₀值显示：6d > 6b > 6f > 6a > 6e > 6c > 6g > 6h。这些结果表明，这类化合物在抑制15-LOX和抑制MCF-7细胞生长方面具有潜力。

化学试剂和材料

所有使用的烷基卤化物和苯异硫氰酸酯均来自Sigma-Aldrich公司。肼水合物（80%）购自E. Merck公司。氢氧化钠、氢氧化钾、甲醇、乙醇、n-己烷、乙酸乙酯、丙酮、氯仿、四氯化碳、碳酸钠、盐酸和硫酸均来自本地供应商，均为分析级。1^H-NMR和13^C-NMR谱在Bruker仪器上以100 MHz和400 MHz频率记录。

CRediT作者贡献声明

迪巴·纳瓦兹（Deeba Nawaz）：负责撰写、审稿与编辑、方法学设计、数据分析。 布什拉·巴希尔（Bushra Bashir）：负责撰写、审稿与编辑、方法学设计、数据分析。 安巴尔·伊克巴尔（Ambar Iqbal）：负责撰写、审稿与编辑、数据可视化、软件应用、方法学设计。 艾莎·莫门（Ayesha Momen）：负责撰写、审稿与编辑、数据可视化、软件应用。 穆罕默德·阿什拉夫（Muhammad Ashraf）：负责撰写、审稿与编辑、原始草稿撰写、项目监督、数据分析。

资助

本研究为自主资助项目，未使用任何外部资金。

利益冲突声明

作者声明没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。

致谢

作者感谢巴基斯坦费萨拉巴德国家生物技术和基因工程研究所（NIBGE）的同事们在MCF-7细胞实验和显微照片处理方面的帮助。同时感谢Sara Mujtaba在引用格式调整和手稿审查方面的协助。