《ACS Biomaterials Science & Engineering》：Bioactive and Injectable Granular Hydrogels Incorporating Decellularized Extracellular Matrix
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本文推荐一篇聚焦组织工程前沿的研究，其核心在于构建了一种结合去细胞化细胞外基质（dECM） 的生物活性与降冰片烯修饰的透明质酸（NorHA） 颗粒水凝胶机械稳定性优势的新型复合体系。该体系不仅具备剪切稀化与自修复特性，可实现微创注射，还能持续释放基质成分并促进纤维软骨细胞（fibrochondrocytes） 的黏附与铺展，为颞下颌关节紊乱（TMDs） 中缺乏再生能力的纤维软骨组织（如颞下颌关节盘，TMJd）修复提供了具有潜力的新策略。
1. 引言
颞下颌关节紊乱是一种常见的肌肉骨骼疾病，在成人/老年人中发病率约为31%，且在女性中更为常见。其典型症状包括疼痛、关节活动受限、磨牙症和咬合音等。作为关节的重要组成部分，颞下颌关节盘在润滑、吸收冲击以及减少关节表面不协调性方面发挥着关键作用。然而，由于其固有的再生能力有限，颞下颌关节盘容易因过度或重复受力而受损，常见的功能障碍包括变薄、穿孔和从原生位置移位。
目前，颞下颌关节盘的修复仍是一个临床挑战。在众多新兴的组织工程解决方案中，去细胞化细胞外基质因去除了细胞成分以降低先天免疫反应，同时保留了天然组织的许多生化特性而备受关注，成为调控细胞黏附、增殖和分化的有力候选材料。然而，尽管dECM水凝胶具有优异的生化性质，但其应用受到低机械性能和相对快速降解的限制。为了改善dECM的性能，研究人员将目光投向了颗粒系统。
颗粒水凝胶是一类通过水凝胶微颗粒（即微凝胶）堵塞而形成的可注射连续三维结构材料。与传统块状水凝胶相比，它们具有微孔性，便于营养物质和氧气的运输，并促进细胞迁移和浸润。此外，颗粒水凝胶还展现出剪切稀化和自愈合行为，允许以微创方式给药。本项研究正是将TMJd来源的dECM的生物活性与基于透明质酸（HA）的颗粒水凝胶的可注射性和稳定性相结合，创造了一种旨在促进细胞黏附和局部ECM释放的新系统。特别地，研究引入了dECM水凝胶作为二次交联剂，利用其在37°C下的热凝胶化特性来原位稳定结构。
2. 材料与方法
2.1. 去细胞化组织的制备与表征
研究使用来自6至8个月大的羔羊头颅的颞下颌关节盘组织，通过结合物理（冻融循环）、化学（Triton X-100处理）和酶学（DNase/RNase处理）方法进行去细胞化。经过消毒和清洗后，材料被冻干、研磨并储存于-20°C。对获得的dECM进行了DNA、硫酸化糖胺聚糖（sGAG）、可溶性及总胶原蛋白的定量分析，并通过组织学染色（H&E、阿尔新蓝、天狼星红）评估了细胞去除与基质保留情况。结果表明，DNA含量显著降低了86%，符合降低免疫原性风险的公认阈值（<50 ng/mg），同时胶原蛋白结构得以保留。
2.2. 微凝胶的生产与表征
首先合成了降冰片烯修饰的透明质酸。随后，通过水包油乳化法制备微凝胶，将含有0.05% LAP（光引发剂）和10 mM DTT（交联剂） 的3% NorHA前体溶液（单独或分别与0.4%、0.8%的dECM水凝胶混合）滴加到油相中，经可见光照射交联10分钟形成微凝胶。研究制备了三种配方：NorHA、NorHA + dECM(0.4%)和NorHA + dECM(0.8%)。通过微吸管抽吸评估单个微凝胶的杨氏模量，并使用流变仪分析堵塞后微凝胶的剪切稀化、自愈合及粘弹性（储存模量G′和损耗模量G″）。此外，还评估了在PBS和II型胶原酶中孵育7天内的蛋白释放情况。
2.3. 交联后的颗粒水凝胶构建体
为了机械稳定颗粒水凝胶，研究评估了两种二次交联策略：一是添加额外的LAP和DTT后，通过可见光照射进行共价交联（称为LAP/DTT交联）；二是将中和后的dECM凝胶与微凝胶混合，利用其在37°C的热凝胶化进行交联（称为dECM交联）。构建体被压缩成圆柱状圆盘（?：4 mm， H：2 mm），并评估了其压缩模量和孔隙率（通过FITC-葡聚糖渗透成像分析颗粒间空隙）。
2.4. 细胞研究
将半月板纤维软骨细胞接种在颗粒构建体上，培养7天。通过固定、透化后，用Alexa Fluor 647标记的鬼笔环肽染色肌动蛋白丝，DAPI染色细胞核，并使用共聚焦显微镜观察细胞形态和铺展情况。通过ImageJ软件分析细胞覆盖率（鬼笔环肽染色面积与总图像面积的比值）。
3. 结果
3.1. 去细胞化基质的评估
去细胞化方案有效移除了细胞物质，显著减少了DNA和sGAG含量，同时保持了可溶性胶原蛋白含量，总胶原蛋白比例因其他成分的去除而相对增加。组织学图像证实了细胞物质的完全去除、sGAG的显著减少以及胶原纤维的保留。
3.2. 水凝胶性能
dECM成功溶解形成粘稠均匀的预凝胶溶液，在37°C下表现出热敏性，储存模量（G′）和损耗模量（G″）显著增加，分别达到约80.9 ± 9.3 Pa和10.6 ± 0.2 Pa，并在约25分钟后稳定。水凝胶表现出剪切稀化行为。冻干过程不影响其凝胶能力或机械性能。在7天内，水凝胶质量损失约7.29 ± 1.44%，并释放出1117.50 ± 82.67 μg/mL的蛋白质，但其压缩模量保持稳定。然而，dECM水凝胶在II型胶原酶中于24小时内完全溶解，表明其需要增强降解稳定性。
3.3. 微凝胶制备与表征
成功制备了三种配方的微凝胶，平均直径无显著差异（约217-224 μm）。微吸管抽吸测试显示，随着dECM浓度增加，微凝胶的杨氏模量显著增加，NorHA + dECM(0.8%)组的模量最高（29.96 ± 0.51 kPa）。流变学分析表明，加入dECM后，堵塞微凝胶的储存模量（G′）和损耗模量（G″）也相应增加，且所有配方均表现出剪切稀化和自愈合能力。在胶原酶中孵育时，含dECM的微凝胶的蛋白释放量是PBS中的约四倍，而纯NorHA微凝胶在两种条件下均未检测到蛋白释放。
3.4. 颗粒水凝胶表征
两种交联策略均形成了多孔结构。在LAP/DTT交联组中，加入0.8% dECM显著降低了颗粒间孔隙率；而在dECM交联组中则增加了孔隙率。力学测试显示，无论采用哪种交联策略，含有0.4% dECM的微凝胶构建体均表现出最高的压缩模量。所有构建体在37°C PBS中孵育7天后，其压缩模量均保持稳定。
3.5. 颗粒水凝胶的细胞相互作用
细胞实验表明，与纯NorHA相比，含有dECM的微凝胶能支持更高的细胞密度。在LAP/DTT交联组中，0.4% dECM组在第7天显示出广泛的细胞球体形成，而0.8% dECM组则表现出更多的细胞铺展。在dECM交联组中，细胞反应更为显著：0.4%和0.8% dECM组在第一天就显示出更高的细胞密度，到第七天时细胞密度进一步显著增加，尤其是0.4% dECM组，细胞形成了更相互连接的网络。这表明dECM介导的交联能显著增强纤维软骨细胞的增殖和网络形成。
4. 讨论
本研究成功地将天然（dECM）与合成（NorHA）材料的优势相结合，利用了dECM提供的生物信号和颗粒水凝胶赋予的生物物理可控性。去细胞化过程有效去除了DNA，尽管损失了部分sGAG，但保留了胶原结构。将dECM封装入NorHA微凝胶中，不仅提高了微凝胶的刚度，还赋予了整个颗粒系统剪切稀化与自愈合特性，使其适合于微创注射治疗。同时，NorHA网络调控了dECM的释放动力学，减缓了其快速降解。
两种二次交联策略（LAP/DTT共价交联和dECM热交联）在孔隙率和力学性能上表现出差异，这归因于微凝胶的堆积行为以及dECM的加入改变了微凝胶的密度和表面性质。在细胞相容性方面，dECM的加入显著改善了细胞的黏附和铺展，其中dECM交联策略，尤其是0.4% dECM配方，在促进纤维软骨细胞形成互连网络方面表现最佳。这可能是因为0.4%的浓度在孔隙率、中间刚度和生物信号暴露之间达到了最佳平衡，为细胞生长创造了更有利的微环境。
研究也指出了当前工作的局限性，例如细胞相互作用研究仅为期7天的初步探索，未来需要更深入地了解dECM对细胞反应的长期作用以及微凝胶的长期稳定性，并需要在特定的组织缺损模型中进行应用验证。
5. 结论
综上所述，本研究成功开发了一种整合了dECM的可注射颗粒水凝胶系统。该系统不仅保持了机械稳定性，具备剪切稀化和自愈合特性，还能响应酶活性控制蛋白释放，其综合性能超越了单独的dECM水凝胶。两种二次交联方法均证明了dECM在支持细胞反应方面的有益作用，尤其是dECM介导的交联能显著增强纤维软骨细胞的增殖和网络形成，这对于纤维软骨组织再生至关重要。未来的研究应侧重于评估其在动态载荷下的长期机械性能，并使用临床相关的颞下颌关节缺损模型在体内评估该系统的再生潜力。
