《Transboundary and Emerging Diseases》：Vaccine-Associated Recombination and Virulence Heterogeneity of GI-19 (QX Type) Infectious Bronchitis Virus in Eastern and Southern China, 2024?2025
编辑推荐：
这篇综述通过分子流行病学监测，系统揭示了2024–2025年间中国东部与南部地区鸡传染性支气管炎病毒（IBV）GI-19（QX型）野毒株的遗传多样性、重组事件及毒力异质性。研究指出，尽管普遍使用H120、4/91或QXL87等减毒活疫苗，但QX型野毒株与疫苗株QXL87的S1氨基酸同源性仅为93.4%–99.8%，且存在与4/91疫苗株的重组；毒力实验显示不同分离株致病性差异显著，交叉中和试验证实其抗原性与疫苗株出现明显偏离。这些发现为优化疫苗选择与开发、防控IBV流行提供了关键依据。
引言
鸡传染性支气管炎（IB）是由鸡传染性支气管炎病毒（IBV）引起的一种急性、高度传染性病毒性疾病。自1930年在美国首次爆发并于1950年代传入中国以来，IBV已成为威胁养禽业的主要病原体。IBV属于γ-冠状病毒属，其基因组为单股正链RNA，长度约27.6 kb。病毒的结构蛋白包括刺突蛋白（S）、包膜蛋白（E）、膜蛋白（M）和核衣壳蛋白（N）。其中，S蛋白在宿主细胞内被蛋白酶切割为N端的S1亚基和C端的S2亚基。S1亚基包含主要的受体结合域（RBD），负责细胞附着，是主要的保护性抗原；而S2亚基则介导病毒包膜与宿主细胞膜的融合。
在中国，IBV目前以多种基因型的复杂混合物形式流行。基于S1基因的系统发育分析，已鉴定出9种基因型（GI–GIX），其中GI型单独包含42个不同的谱系。在这些谱系中，QX型（GI-19）在中国占主导地位，而4/91型（GI-13）自1991年在欧洲首次出现后已传播至全球。值得注意的是，4/91型毒株显示出广泛的重组潜力，容易与QX型毒株交换遗传片段，进一步使流行病学情况复杂化。目前，IB主要通过接种减毒活疫苗或灭活疫苗来控制。然而，IBV的高突变率和毒株间重组的倾向显著降低了抗原性不同的血清型或基因型毒株之间的交叉保护效力。因此，当前的疫苗无法对流行的野毒株提供强有力的免疫保护，从而促进了病毒逃逸并使疾病控制复杂化。
为了深入了解中国东部和南部地区IBV的分子流行病学，研究团队在2024年5月至2025年2月期间进行了一项监测计划。从四个省份（江苏、安徽、山东和广东）的商业黄鸡群中分离出49株IBV野毒株，这些鸡群均接种过H120、4/91或QXL87疫苗。通过对完整S1基因的系统发育分析，所有分离株均归属于GI-19（QX型）或GI-13（4/91型）谱系。值得注意的是，QX型分离株与QXL87疫苗株（S1氨基酸同源性93.4%–99.8%）表现出显著的遗传差异，并形成了几个主要的进化支，由四个毒株代表：CK/CH/XZ/240457（XZ240457）、CK/CH/CZ/240601（CZ240601）、CK/CH/WF/24054（WF24054）和CK/CH/WF/526（WF526）。这种抗原漂移可能是当前疫苗保护效果不理想的关键因素。针对S1区域的重组分析鉴定出三个源自QX型和4/91型亲本毒株的分离株。在1日龄无特定病原体（SPF）鸡中对四个代表性QX型分离株和重组株AH240519（以QXL87为主要亲本）进行的毒力测试，导致了不同程度的死亡率以及呼吸系统和肾脏组织的特征性组织病理学损伤。
材料与方法
研究使用了由济南斯艾斯家禽有限公司提供的SPF鸡胚和1日龄SPF鸡。在2024年5月至2025年2月期间，从出现呼吸道症状（如咳嗽、喘息、啰音和流鼻涕）的病弱鸡中采集了540份口咽和泄殖腔拭子。样本来自中国四个省份的鸡群，所有鸡群均接种了由QYH生物科技有限公司提供的减毒活疫苗H120（FJ888351）、4/91（KF377577）或QXL87（MH743141）。病毒分离通过将样本在-80°C冻融三次，离心取上清，然后在9日龄SPF鸡胚尿囊腔中进行三代盲传。使用RT-qPCR鉴定病毒阳性。通过RT-PCR扩增IBV的S1基因并进行测序，使用MEGA（11.0版）进行多序列比对，并基于邻接法构建系统发育树。使用RDP4（Recombination Detection Program 4）软件进行重组分析，并通过SimPlot（3.5.1版）进行相似性绘图分析验证。通过将病毒接种9日龄SPF鸡胚并测定EID50来评估病毒滴度，并通过RT-qPCR测定不同时间点的病毒RNA拷贝数以绘制生长曲线。选择五个S1氨基酸与QXL87疫苗株差异超过5%且属于不同主要系统发育支系的毒株（包括四个GI-19毒株和一个重组株AH240519）进行毒力测试。将120只1日龄SPF鸡随机分为6组，每组20只，感染组通过眼鼻途径接种105.0EID50的病毒，对照组接种PBS。连续14天监测临床症状和死亡率，并在感染后特定时间点收集组织样本用于组织病理学检查和病毒载量测定。病毒交叉中和试验使用抗QXL87血清进行，计算交叉中和R值以评估抗原相关性。使用ESPript 3.0进行S1氨基酸序列比对，并基于M41刺突蛋白冷冻电镜结构（PDB: 6CV0）通过SWISS-MODEL进行同源建模，使用PyMOL（v2.5.4）评估突变残基的结构影响。数据使用GraphPad Prism（7.0版）进行统计分析。
结果
流行情况和系统发育分析
在2024年至2025年间，540份样本中有168份RT-qPCR检测为阳性，阳性率为31.11%。共从四个中国省份成功分离出49株IBV：江苏（n=12，24.49%）、安徽（n=22，44.90%）、山东（n=13，26.53%）和广东（n=2，4.08%）。所有分离株均归类为GI基因型，主要为GI-19（n=40，81.63%），其次是GI-13（n=6，12.24%）以及GI-19和GI-13的重组株（n=3，6.12%）。
S1基因的高度多样性
S1氨基酸序列比对显示，分离株之间以及分离株与疫苗株之间均存在显著差异。GI-19分离株与QXL87的S1氨基酸同源性在93.4%到99.8%之间，而GI-13分离株与4/91疫苗株的同源性较高，在98.9%到99.1%之间。五个与QXL87进化距离较远的分离株（AH240519、XZ240457、CZ240601、WF24054和WF526）与QXL87的S1氨基酸同源性分别为89.4%、93.9%、95.0%、93.3%和93.9%。
4/91和QX型的三重重组体
使用RDP4软件对S1基因进行重组分析，鉴定出三个分离株（AH240519、CZ240536和WF2407）的S1基因存在重组事件。AH240519是由QXL87（主要亲本）和4/91重组产生的；而CZ240536和WF2407则以4/91为骨架（主要亲本），QXL87提供了离散的内部区域。这些重组事件显著增加了IBV的遗传多样性，并突显了S1区域的模块化进化。
五个QX型分离株的生物学特性
选择四个QX型分离株和重组株AH240519进行生物学特性研究。所有毒株均能在SPF鸡胚中引起严重的发育迟缓和矮小化病变。生长动力学分析显示，重组株AH240519在感染后24小时的病毒滴度显著高于其他四个分离株，表明与4/91的重组可能赋予其短期复制优势。而WF526在所有时间点的病毒载量均最低，提示其毒力可能减弱。
SPF鸡中QX型分离株的毒力评估
在1日龄SPF鸡中评估五个分离株的毒力。结果显示，毒力谱存在明显差异。感染AH240519和XZ240457的鸡出现严重的呼吸道症状，死亡率分别为40%和50%。感染CZ240601或WF24054导致较轻的疾病，死亡率为20%。而WF526仅引起短暂、轻微的临床症状，存活率为100%。口咽和泄殖腔的病毒排毒在所有攻毒组（除WF526在3天时外）的3、6、9和14天均持续较高。气管、肺和肾脏组织的病毒载量在感染后6-9天达到峰值，随后逐渐下降，但到14天时仍可检测到病毒RNA。AH240519和XZ240457在这些组织中的病毒基因组拷贝数显著高于其他组，证实了它们对呼吸道和泌尿道的显著嗜性以及与其较高毒力相对应的持续病毒排毒。
气管、肺和肾脏的病理损伤
感染后6天的剖检观察显示，除WF526攻毒组外，所有病毒感染组均出现明显的病变。感染AH240519、XZ240457、CZ240601和WF24054的鸡气管出现广泛的黏膜下出血并伴有大量黏液性渗出物。WF526仅引起轻微的分泌物。所有感染组的肺部病理均较严重，有明显的充血和水肿，但AH240519和XZ240457还表现出广泛的肺坏死。除WF526外，所有组的肾脏病变均表现为典型的“花斑肾”表型——肾脏肿大伴多灶性白色尿酸盐沉积。组织病理学分析进一步证实了这些差异。气管组织显示明显的黏膜增厚、广泛的上皮脱落以及异嗜细胞和单核细胞密集浸润。肺组织表现出明显的毛细血管充血、多灶性出血、间隔增厚和显著的炎症细胞浸润。肾组织以肾小球萎缩、广泛的肾小管上皮坏死和间质内明显的炎症浸润为特征。相比之下，WF526组的组织仅显示最小病变，组织结构基本完好，炎症细胞浸润极少，没有广泛的上皮损伤或坏死证据。
IBV分离株与QXL87的交叉中和试验
交叉中和试验评估了分离株与QXL87疫苗株之间的抗原相关性。所有五个毒株与QXL87的交叉中和R值均超过11%，表明它们与QXL87属于同一血清型，但中和能力存在差异。CZ240601和WF526的R值分别为44.75%和33.98%，表明存在较小的亚型差异。相比之下，AH240519、XZ24057和WF24054则观察到主要的亚型差异，R值分别为13.32%、23.71%和21.50%。AH240519与QXL87的R值最低，表明重组事件可能通过降低S1基因同源性使病毒能够逃避QXL87的中和作用。
S1亚基的建模分析
对四个QX型分离株、一个重组株和QXL87疫苗株的S1氨基酸序列进行多序列比对，揭示了导致近期抗原漂移的独特氨基酸替换。在流行QX病毒中保守但与QXL87不同的八个残基位于S1亚基的N端结构域（NTD）或C端结构域（CTD）内。将五个位于溶剂可及表面的替换（Thr125Ile、Thr143Ser、Leu167Phe、Asp337Glu和Arg369Lys）投射到以M41刺突蛋白为模板构建的QXL87 S1三聚体同源模型上。结构建模显示，每个替换都扰乱了局部结构。
讨论
自20世纪80年代在中国出现以来，IB已成为威胁养禽业的最重要疾病之一。尽管广泛使用多种疫苗来控制其传播，但不同IB毒株的爆发仍频繁被报道。本研究中，尽管常规免疫使用了减毒活疫苗H120、4/91或QXL87，但在2024年5月至2025年2月期间仍从中国东部和南部的商业黄鸡群中分离出49株IBV野毒株。与疫苗接种鸡群中反复出现的QX型爆发一致，GI-13野毒株与4/91疫苗株的差异极小，而GI-19分离株与QXL87的相似性显著降低，其范围超过了通常认为指示血清型转变的5%阈值。这种抗原漂移可能是当前疫苗保护不完全的潜在原因。
相应地，研究重点分析了QX型分离株的基因组和表型特征。S1基因的系统发育分析揭示了40个QX型分离株和重组株AH240519之间存在显著的异质性，它们分化为五个不同的谱系。攻毒实验揭示了五个系统发育上不同的QX型分离株之间存在明显的毒力异质性。先前的研究表明，QXL87和4/91之间的重组可能导致高致病性毒株的出现。重组株AH240519引起了40%的死亡率，这与毒性最强的亲本QX毒株的死亡率在统计学上无差异。这一发现表明，重组可以在改变抗原性的同时保持甚至增强毒力。这些数据加深了人们的担忧，即同时使用多种活疫苗可能会无意中加速新型重组株的产生。
为了阐明此类强毒重组株的出现，研究其潜在的分子机制至关重要。重组是冠状病毒复制的重要组成部分，对于产生亚基因组RNA（sgRNA）至关重要，并且与新毒株的出现密切相关。IBV易出错的RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp）在sgRNA合成过程中频繁切换模板，产生嵌合中间体和镶嵌基因组。AH240519、WF2407和CZ240536毒株都是4/91和QXL87疫苗株在S1基因内同源重组的结果。S1亚基占据了刺突糖蛋白的N端一半，含有主要的病毒中和表位，是疫苗诱导的保护性抗体的主要靶标。然而，由于S1亚基是疫苗诱导中和抗体的主要靶标，它受到强烈的免疫选择压力，在这种压力下，病毒倾向于通过突变或重组来逃避疫苗接种赋予的免疫力。
在中国同时使用4/91和QX活疫苗，会产生一个21-28天的时期，期间疫苗病毒排毒与野毒株共感染重叠。4/91的S1结构域主要靶向上呼吸道上皮，而QX的S1结构域则引导病毒在肾小管中复制。融合了这些决定因素的重组事件使子代病毒能够利用两种进入途径，从而扩大组织嗜性，增加累积病毒载量，延长排毒时间，并增强后续传播。与因适应性成本而迅速减弱的点突变体不同，这些S1重组体获得了多个中和表位和双重嗜性，而没有额外的适应性代价，并且可以在农场内持续流行多年。
为了评估流行分离株与QXL87疫苗株之间的抗原相关性，进行了交叉中和试验。尽管所有分离株的R值均高于11%，表明不存在明确的血清型转变，但观察到对QXL87的交叉中和活性有不同程度的降低。总的来说，流行分离株之间的这些抗原差异可部分归因于S1亚基内的渐进性分化。鉴于S1氨基酸序列同源性与交叉中和R值之间存在正相关，这种分化可能导致QXL87疫苗对当前野毒株的保护效力降低。然而，对分离株的抗原分析进一步表明，抗原变异不能仅由S1氨基酸同一性决定，因为某些关键残基可能对抗原相关性产生关键影响。对五个分离株的结构分析进一步确定了S1亚基内的几个氨基酸替换。先前的研究报告称，HVR（高变区）内异质性的增加与抗原相似性的降低有关。在本研究中，关键替换（包括Thr125Ile、Thr143Ser、Leu167Phe、Asp337Glu和Arg369Lys）位于溶剂可及表面，可引起局部构象变化，从而削弱抗体结合并降低抗原性。这些替换共同重塑了关键的中和表位，并重新定义了S1亚基的抗原格局。积累的分化减少了与QXL87疫苗株的抗原重叠，促进了免疫逃逸，并促成了最近的QX型爆发。
综合证据表明，应更新疫苗配方，以包含本研究中鉴定的主要进化支的代表性抗原。持续的基因组和抗原监测对于检测抗原漂移和指导迭代疫苗重新配制至关重要。
