《Transboundary and Emerging Diseases》：Portable Molecular Diagnostics for Cetacean Morbillivirus: Development of a Reverse Transcription Insulated Isothermal PCR (RT-iiPCR) for Global Surveillance
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本研究开发并评估了一种针对鲸类麻疹病毒（Cetacean morbillivirus, CeMV）的便携式反转录隔热等温PCR（reverse transcription-insulated isothermal PCR, RT-iiPCR）诊断方法。该方法靶向高度保守的磷蛋白（P）基因片段，在低拷贝条件下展现出优异的分析灵敏度与临床一致性。与传统的RT-qPCR相比，该便携式平台（包含POCKIT分析仪与TacoTMmini核酸提取系统）可在约58分钟内完成检测，无需依赖大型实验室设备与冷链，为资源有限的搁浅救助现场、野外及边境地区的CeMV快速筛查、尸体分拣与全球监测提供了切实可行的解决方案。
引言
鲸类麻疹病毒（Cetacean morbillivirus, CeMV）是一种线性、非节段、负义单链RNA病毒，属于副粘病毒科（Paramyxoviridae）麻疹病毒属（Morbillivirus）。该病毒包括至少8个已知谱系，可感染多种鲸豚类动物，导致系统性急慢性疾病和持续性局部脑炎，是引发鲸类不寻常死亡事件（unusual mortality events, UMEs）的主要病原体之一。虽然CeMV在全球分布，但受限于传统诊断方法（如病毒分离、ELISA、免疫组化及依赖大型仪器的RT-qPCR）对实验室基础设施、冷链和熟练人员的严苛要求，其全球监测呈现不均衡状态。特别是在资源有限的沿海地区，诊断能力的缺乏导致许多病例未被识别，阻碍了对病毒地理分布、流行规律和跨物种传播风险的全面理解。因此，开发一种便携、快速、广谱且易于在野外部署的诊断工具，对于建立有效的跨境CeMV监测网络、实现早期预警和及时响应至关重要。
材料与方法
本研究针对CeMV磷蛋白（P）基因的保守区段，设计了特异性引物和探针，其中正向引物引自文献，反向引物和探针为本研究新设计。同时，设计了靶向宽吻海豚（Tursiops truncatus）β2-微球蛋白（β2-microglobulin, B2M）基因的引物和探针，用作内部对照。通过生物信息学分析验证了引物和探针的特异性。该检测在便携式POCKIT核酸分析仪（GeneReach）上运行，配合TacoTMmini磁珠核酸提取系统，构成完整的现场检测平台。整个工作流程包括组织匀浆、核酸提取、将提取的核酸加入含有冻干试剂的预混液，转移至R-tube，然后在POCKIT分析仪中进行约58分钟的RT-iiPCR反应，仪器自动分析荧光信号并输出阳性（+）、阴性（-）或可疑（?）结果。
性能评估结果
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分析灵敏度：使用合成的BWMV谱系RNA模板进行测试，RT-iiPCR在513至62,560拷贝/μL浓度范围内实现了100%检出。通过概率单位分析估算的95%检测限（LOD95）为139拷贝/μL。
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临床灵敏度：通过将系列稀释的CeMV RNA模板添加至经确认阴性的海豚脑组织和肺组织提取物（“提取后添加”）或组织中（“提取前添加”）来模拟低拷贝临床样本。单重（仅检测CeMV P基因）RT-iiPCR在不同添加顺序下均能维持100%的检出率，直至循环阈值（Ct）值约33，表明在检测极限附近的失败主要归因于模板稀缺，而非核酸提取过程中的损失。当采用双重反应（同时检测CeMV P基因和B2M内参基因）时，虽引入了轻微灵敏度代价，但仍能在Ct值约30-31时维持完美检出，B2M的共扩增为核酸提取和逆转录过程提供了有效质控。
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与RT-qPCR的一致性：在低拷贝样本中，RT-iiPCR与RT-qPCR整体一致性较高。单重检测的总Kappa值为0.76，脑组织样本的一致性尤其高（κ= 0.85）。双重检测的总Kappa值为0.68，其中脑组织样本一致性为0.87，而肺组织样本一致性较低（κ= 0.55），这完全是由Ct > 33样本的假阴性结果导致，未出现假阳性结果。
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广谱性与实用性验证：利用来自西班牙、巴西、夏威夷等地存档长达28年的福尔马林固定石蜡包埋（formalin-fixed paraffin-embedded, FFPE）组织样本进行验证。该RT-iiPCR方法成功检出了五个不同的CeMV谱系，包括海豚麻疹病毒（DMV）、领航鲸麻疹病毒（PWMV）、喙鲸麻疹病毒（BWMV）、圭亚那海豚麻疹病毒（GDMV）和弗氏海豚麻疹病毒（FDMV）。序列比对表明，该方法预计也能覆盖其他已知谱系（如PMV、DMV NE-Atlantic）。
讨论与意义
本研究开发的RT-iiPCR是首个将广谱CeMV检测、便携式平台与内置提取质控（B2M内参）相结合的前沿诊断方案。与依赖大型设备、冷链和高级实验室的传统分子诊断方法相比，该平台具有显著优势：整个检测系统可集成于一个坚固的防护箱中，便于运输和现场部署；使用冻干试剂，对高温高湿环境适应性强；工作流程简单快速，从样本到结果约一小时，适合在资源有限的搁浅现场、边境口岸及区域实验室使用。
该技术的应用将有助于填补全球，特别是西太平洋、印度洋等监测薄弱地区的CeMV流行病学数据空白。通过实现快速现场筛查，可以对阳性样本进行优先排序，以便后续进行详细的病理学分析和全基因组测序，从而更深入地理解病毒的演化、传播动态和跨物种传播潜力。在气候变化、海洋环境压力增大的背景下，建立强大、均质化的跨境监测网络对于及早发现疫情、保护易危鲸类种群、维护海洋生态系统健康具有重要的科学和保育价值。尽管本研究验证的样本量有限，且双重反应在肺组织中对极低拷贝样本的灵敏度有所降低，但该方法在模拟真实世界低病毒载量挑战下的表现，以及其出色的特异性、广谱性和便携性，使其有潜力成为支撑全球CeMV监测、应对不寻常死亡事件的实用化现场诊断工具。
