《Journal of Chromatography Open》：Analytical Quality by Design approach in the development of a green reversed-phase ultra-high performance liquid chromatography/high-resolution time-of-flight mass spectrometry method for the simultaneous analysis of synthetic antimicrobial and hypotensive peptides
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来自Tityus stigmurus蝎毒及其类似物的肽类物质在治疗领域的日益关注，凸显了开发针对这些化合物的稳健分析方法的必要性。然而，传统的方法开发往往效率低下，未能充分考虑影响分析质量的色谱参数之间的复杂相互作用。本研究旨在应用分析质量源于设
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来自Tityus stigmurus蝎毒及其类似物的肽类物质在治疗领域的日益关注，凸显了开发针对这些化合物的稳健分析方法的必要性。然而，传统的方法开发往往效率低下，未能充分考虑影响分析质量的色谱参数之间的复杂相互作用。本研究旨在应用分析质量源于设计（AQbD）方法，开发一种高效且稳健的方法，用于同时分离四种合成肽（Stigmurin、两种类似物及TistH）。研究人员采用AQbD框架，利用风险评估识别关键变量和属性。通过两个两水平筛选实验设计和一个三水平优化实验设计，评估了色谱柱类型、流动相组成和流速的影响。统计分析生成了模型和响应面图，以确定最佳操作区域。核壳颗粒色谱柱展现出优越的性能，所有肽均实现了基线分离。统计模型确认流动相组成是最具影响力的因素。所定义的设计空间确定了最佳操作区域：40-43%（v/v）有机流动相、20-40°C及0.25-0.4 mL/min的流速。绿色度分析确认该方法可被视为绿色分析方法。AQbD方法成功创建了一种可靠、绿色且适用于肽分析的超高效液相色谱-飞行时间质谱（UHPLC-ToF-MS）方法，为此应用提供了灵活且高性能的工具。该方法为开发其他肽混合物的稳健分析方法提供了有价值的蓝图，确保了质量和可重复性。
论文解读文章
**一、研究背景与问题提出**
蝎毒是生物活性分子的丰富来源，其中肽类化合物因具有免疫调节、溶血、抗菌及缓激肽增强等多种功能而备受关注，被认为是药物开发的重要候选分子。巴西特有的Tityus stigmurus蝎毒中含有已确认具有抗菌和降压活性的生物活性分子，在生物技术和制药领域展现出应用潜力。对Tityus stigmurus毒液的转录组学分析揭示了多种活性肽，其中Stigmurin是最丰富的转录本，这是一种由17个氨基酸残基组成、富含苯丙氨酸且具有酰胺化C端、不含二硫键的肽，具有广谱生物活性。基于天然肽的序列，研究者合成了多种类似物，包括具有增强抗菌活性和抗克氏锥虫作用的StigA8和TsAP-2，以及具有降压活性的TistH（一种由25个氨基酸残基组成、分子量2.7 kDa、在pH 3-9范围内结构稳定的肽）。
尽管肽类治疗产品市场快速增长，其治疗潜力、高特异性、对细胞靶标的选择性及低毒性使其在抗菌、抗肿瘤、创面愈合和抗高血压等疾病治疗中具有重要价值，但肽类药物制剂面临严峻挑战：肽类对其降解高度敏感，因此理解肽的降解机制对于开发更安全、更有效和更稳定的制剂至关重要，同时开发评估其质量的分析方法也必不可少。然而，目前针对肽和肽制剂的稳健分析方法的开发文献记载不足，传统方法开发仍占主导地位，但传统"单因素逐一考察"方法无法识别因素间的交互作用，效率低下且耗时。近年来，QbD等现代稳健方法日益受到关注。
色谱方法是肽分析的主要工具，其中高效液相色谱结合光电二极管阵列检测器（PDA）、紫外（UV）或质谱（MS）检测较为常见。超高效液相色谱-飞行时间质谱（UHPLC-ToF-MS）系统可为肽段提供灵敏快速的检测，具有高质量精度，对肽图谱分析、鉴定以及翻译后修饰检测和从头测序至关重要。然而，色谱方法的优化涉及调整流动相、pH、色谱柱、温度和流速等多个因素，以实现理想的保留时间、分离度和峰形等分析响应。方法开发中需要理解影响因素之间的关系及其对分析响应的影响，因此需要采用现代方法。
质量源于设计（QbD）作为ICH Q8 (R1)定义的一种系统性方法，通过过程理解、控制、科学证据和质量风险管理来确保产品质量，具有提高过程稳健性、持续改进、减少偏差、降低成本以及减少再验证需求带来的监管灵活性等优势。分析质量源于设计（AQbD）对于开发稳健、经济且适用目的的药物分析方法至关重要，可减少失败、控制变异性并优化方法，确保一致、可靠和高质量的结果。本研究旨在应用AQbD方法开发一种可同时分离和分析来源于Tityus stigmurus毒液的四种关键合成肽的UHPLC-ToF-MS方法，要求达到分离度（Rs）大于2，并满足理论塔板数、拖尾因子和分析时间等可接受标准。
**二、研究方案与关键技术方法**
研究人员采用了AQbD方法论，将其分为方法规划和方法理解两个主要阶段。在方法规划阶段，定义了分析目标概况（ATP）并进行了初步风险分析，构建了石川图（Ishikawa diagram）以识别影响方法性能的潜在因素和关键质量属性（CQAs）。在方法理解阶段，利用实验设计（DoE）进行筛选和优化，包括采用两水平析因设计进行筛选（评估流速和流动相B比例两个变量，分别使用两种不同技术类型的色谱柱），以及采用三水平全析因设计进行优化（评估流动相B比例、流速和温度三个变量）。统计分析包括方差分析（ANOVA）、扰动图、帕累托图、响应面图和叠加图，以确定设计空间和方法可操作设计区域（MODR）。研究还通过分析绿色ness评估工具（AGREE）和Analytical Method Greenness Score (AMGS)评估方法的环保性，并使用Blue Applicability Grade Index (BAGI)评估方法的实用性。色谱分离在UHPLC/MS-ESI TOF系统上进行，采用了两种色谱柱比较：ZORBAX 300Extend-C18（全多孔颗粒）和Kinetex 2.6 μm C18（核壳颗粒）。四种合成肽（Stigmurin、StigA8、TsAP-2和TistH）分别购自巴西Aminotech Ltd和GenOne Ltd，纯度分别为98%、87.09%、96.54%和79.55%（m/m）。
**三、研究结果**
**3.1 规划方法：先验知识、ATP定义和风险评估**
研究人员首先对四种肽进行了计算机模拟表征，获得了平均质量、等电点、净电荷、摩尔吸收系数、GRAVY指数和亲水性残基含量等理化性质数据。分析表明，这些肽在280 nm处的摩尔吸收系数为零，因为该波长仅对含有芳香族氨基酸（酪氨酸、色氨酸或苯丙氨酸）的肽有吸收，而本研究的肽在215 nm处（肽键最大吸收波长）有吸收，但这种检测缺乏选择性。因此，UHPLC-MS比UHPLC-DAD更具优势，能提供更高的选择性和灵敏度。TistH具有负GRAVY指数，表明其为亲水性分子，预期最先洗脱；而Stigmurin、StigA8和TsAP-2具有较高的GRAVY分数，疏水性更强，预期保留时间更长。基于此，选择乙腈作为有机改性剂，甲酸作为酸性改性剂。ATP定义明确了分析物为四种合成肽，分析技术为UHPLC/MS-ESI-TOF，关键方法参数包括分离度、理论塔板数、拖尾因子和保留时间，方法需准确、精密、选择性和线性良好，适用于含有多种肽的注射制剂分析。风险分析通过石川图系统识别了影响方法性能的关键因素，确定有机流动相百分比、流速和色谱柱性质（包括长度、技术和粒径）为关键方法参数（CMPs）。
**3.2 通过质谱鉴定肽**
由于肽的分子大小，它们表现为多达五个质子化离子，所有目标肽均鉴定出双质子化离子。考虑到含有高碳原子数的分子其最丰峰可能不是单同位素峰，研究纳入了同位素原子的分析，鉴定出含有最多两个重13C同位素的峰，与理论质量的对应关系确认了肽的身份，质量误差低于15 ppm。洗脱顺序确定为：TistH最先洗脱，随后依次为StigA8、TsAP-2，最后为Stigmurin。在Stigmurin、TsAP-2和StigA8的质谱中观察到m/z约120.08的碎片离子，对应苯丙氨酸衍生的亚胺离子，是肽序列中存在苯丙氨酸残基的特征性诊断碎片。
**3.3 方法规划：关键方法参数筛选的实验设计（两水平析因设计）**
筛选实验的结果表明，在大多数色谱运行中，四种肽无法同时分离。在较低流速和较低有机流动相比例条件下，肽的洗脱时间不足，导致色谱图不完整；而在较高参数值条件下，则发生共洗脱。Zorbax色谱柱由于长度较短，洗脱时间显著缩短；而Kinetex色谱柱则产生更窄和更对称的峰。仅方法3、4和8能够以良好的临界对分离度分离四种肽。通过对方法4和8的直接比较（相同流动相和流速条件，仅色谱柱不同），核壳颗粒色谱柱的优越性得以体现：提供了更窄的峰宽和更高的分离效率，多数肽的理论塔板数（N）值更高，所有临界对的分离度大于2，而全多孔色谱柱多数肽的N值低于2000。此外，洗脱顺序与预期存在偏差，TsAP-2在Stigmurin之前洗脱，尽管其表观疏水性更高，表明除整体疏水性外的其他因素（如与固定相的次级相互作用、离子对效应和溶液中的三维构象）影响保留行为。
**3.4 方法理解：优化筛选的实验设计（三水平全析因设计）**
优化阶段使用了27种方法，分析结果表明使用40%有机流动相的方法均实现了完全分离且分离度大于2，较高流速的方法分析时间显著缩短。所建立的统计模型均具有统计学显著性（p值小于0.05），预测R2为正值，预测R2与校正R2之差小于2，充分精密度值均高于4。扰动图显示，流动相组成（%B）是对分析时间和三个临界对分离度影响最大的因素；随着B百分比增加，保留时间和分离度值均降低。温度升高导致保留时间和分离度增加，而流速增加则使这些响应降低。帕累托图证实了有机流动相百分比的主导性影响，表现出线性和二次效应，其次是流速的线性影响。响应面分析表明，较低的有机流动相百分比通常导致更高的分离度值。对于第一个临界对（TistH和StigA8），在约45%有机流动相以下观察到满意值（Rs>2）；对于第二个临界对（StigA8和TsAP-2），低于48%有机流动相可提供满意的分离度；对于第三个临界对（TsAP-2和Stigmurin），最佳分离度值在44%-48%流动相B范围内获得。设计空间分析表明，较高的温度下设计空间扩大，流速对响应适宜性影响最小，但有机流动相百分比需维持在41%-45%之间。中间流速0.3 mL/min产生最大的设计空间面积。在有机流动相比例为41%-43% B时观察到更大的方法可操作设计区域（MODR），可容纳30-40°C的温度和宽范围的流速。42%有机流动相组成提供了最大的理想工作区域。通过期望函数进一步优化，在42% B、流速0.35 mL/min和温度35°C的条件下验证了MODR，该条件不在初始实验设计范围内。结果表明，Stigmurin的保留时间减少至8分钟以下，所有临界对保持大于2的分离度，拖尾因子在理想范围内，保留因子（k）上限降低但仍满足标准。
**3.5 方法绿色性和实用性分析**
AGREE评价获得了0.64的最终得分，表明方法具有高度的可持续性。主要不足包括：原则11（毒性）因使用有毒溶剂乙腈和腐蚀性甲酸而被标记为最显著缺陷；原则12（安全性）因乙腈的高易燃性而未能达到绿色状态；原则7（废物）因色谱运行中产生的有机废物总量而受到扣分。积极方面包括：原则2（样品量）因仅需1 mg样品而显著改善得分；原则5（自动化）因使用自动化MS-ESI-TOF系统而表现良好；原则6（小型化）因使用减小的样品体积（10 mL储备溶液）和低流动相消耗而被强调为优势。AMGS计算得分为43.69，被认为是相对较低的值，方法符合绿色分析化学原则。BAGI评分达到82.5的高分，主要得益于使用大多数实验室常用的仪器、多元素分析能力（针对2-5种同类化合物）、同时制备2-12个样品的能力、每小时5-10个样品的处理量、简化或无需样品制备步骤、使用常见商业试剂以及半自动化工作流程。
**3.6 研究局限性**
尽管开发的UHPLC-ToF-MS方法成功优化且稳健，但存在若干局限性：首先，尽管方法符合绿色分析化学原则，但肽溶解性和电离兼容性决定了必须使用乙腈和甲酸，带来了溶剂毒性和易燃性方面的不可避免的挑战；其次，TsAP-2和Stigmurin的洗脱顺序表明保留受复杂的次级相互作用和构象因素控制，这些因素对于本研究未包含的其他肽序列可能显著不同。
**四、讨论与结论**
本研究成功展示了应用QbD方法开发稳健肽分离色谱方法的有效性，强调了多因素优化对分析质量的重要性。研究确认色谱柱的选择是关键因素，核壳色谱柱（Kinetex）通过更高的理论塔板数和更好的峰对称性，相比全多孔色谱柱提供了显著更高的效率，所有临界对获得大于2的分离度且N值远高于2000。为分析时间、临界对分离度和Stigmurin理论塔板数建立的统计模型表现出高质量，验证了该方法用于优化和界定方法可操作设计区域（MODR）的适用性。响应面图、帕累托图和分析设计空间揭示了有机流动相比例（%B）是对分离度和保留时间影响最大的因素，较低的B百分比（理想情况下在40%-42%之间）有利于缩短分析时间同时保持足够的分离度。流速和温度也影响响应，较高的温度和流速扩大了设计空间区域，但温度对肽保留时间的影响较小。该方法允许识别多个理想分离条件，分析时间范围为6至20分钟。特定MODR确定为有机流动相百分比40%-43%、温度20-40°C、流速理想范围为0.25-0.4 mL/min。该研究证实较高比例的流动相和较高流速导致分析时间合意地缩短，证明了实验设计（DoE）在建立灵活且高性能的肽分离分析方法方面的有效性。根据绿色分析化学原则，所开发的方法被归类为可持续方法，具有样品需求量小、自动化程度高和有效小型化的显著优势。BAGI评分82.5证明了该方法在日常实验室环境中的高实用性和易实施性。该AQbD方法论为开发其他肽混合物的稳健分析方法提供了有价值的模板，确保质量和可重复性。该研究发表在《Journal of Chromatography Open》。
