《Archives of Toxicology》：The use of new approach methodologies (high-throughput transcriptomics) to study nanoagrochemicals: mechanisms of toxicity of a commercial copper oxychloride to soil model invertebrates (Enchytraeus crypticus)
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纳米农用化学品旨在提高安全性和可持续性，代表了传统农用化学品的替代品。鉴于该领域处于起步阶段，纳米农用化学品的风险-效益分析仍未解决。新方法学（New Approach Methodologies, NAMs），如组学（omics），已成为超越标准危害评估的重
纳米农用化学品旨在提高安全性和可持续性，代表了传统农用化学品的替代品。鉴于该领域处于起步阶段，纳米农用化学品的风险-效益分析仍未解决。新方法学（New Approach Methodologies, NAMs），如组学（omics），已成为超越标准危害评估的重要议程，因为对毒性机制的研究提供了理解风险的有价值信息。NUCOP–M?，一种含有纳米特征的铜基商业制剂，先前在隐氏白线蚓（Enchytraeus crypticus，环节动物门）中进行了评估，基于标准经济合作与发展组织（OECD）蚯蚓繁殖试验（28天）及其扩展（56天），影响了存活和繁殖。本研究的目的是使用含有44,000个基因探针（4×44K微阵列）的高通量基因表达微阵列（NAMs），在短期和较长暴露（2、21天）下，理解NUCOP–M?在亚致死浓度（100和500 mg Cu/kg土壤）下的毒性机制。结果显示，在21天暴露后观察到高转录组响应，尽管在2天后有细胞内运输增加的迹象。在21天，基因表达谱与胚胎发育效应一致，这可能与28天和56天暴露观察到的繁殖效应相关。几个上调的基因指向线粒体应激和激活应对氧化应激的机制。这项研究提供了对纳米农用化学品在非靶标物种中毒性机制的重要见解，填补了一个重要的知识空白。
**论文解读：纳米农用化学品NUCOP–M?对土壤无脊椎动物隐氏白线蚓的毒性机制**
该论文发表于《Archives of Toxicology》，聚焦于纳米农用化学品的安全性问题。研究背景显示，纳米农用化学品旨在提升传统农用化学品的效率与可持续性，但当前该领域尚处早期，其风险-效益分析未能明确。传统铜基农药（如碱式氯化铜）已使用数十年，但其纳米制剂（如NUCOP–M?）对非靶标土壤生物的毒性机制几乎未知。先前的研究基于标准OECD蚯蚓繁殖试验（28天）及其扩展（56天），发现NUCOP–M?对隐氏白线蚓（
Enchytraeus crypticus）的存活和繁殖产生显著影响，但分子层面的机制尚未阐明。因此，研究人员开展本研究，旨在利用新方法学（NAMs）中的高通量转录组学，揭示NUCOP–M?在亚致死浓度下的毒性作用通路，填补该领域的知识空白。
研究人员通过暴露实验，将隐氏白线蚓暴露于含有NUCOP–M?（100和500 mg Cu/kg土壤）的LUFA 2.2自然土壤中，分别于2天和21天收集样本，利用定制的高通量基因表达微阵列（4×44K格式，包含44,000个基因探针）进行转录组分析。数据经标准化和差异表达分析（limma，Benjamini-Hochberg校正，调整后p<0.05），并开展基因本体（GO）富集和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析。主要关键技术方法包括：使用隐氏白线蚓实验室培养种群（超过10年），以LUFA 2.2土壤（德国LUFA Speyer）为介质，暴露于NUCOP–M?水悬浮液；采用Agilent单色标记方案进行RNA提取、标记和杂交；数据通过R语言和Bioconductor包处理，差异表达基因（DEGs）进行聚类分析和主成分分析（PCA）。
**研究结果如下：**
**1. 差异表达基因（DEGs）数量**
在29,009个高质量探针中，共64个转录本在至少一个测试条件下显著差异表达（调整后p<0.05）。绝大多数DEGs出现在500 mg/kg暴露组（21天），而100 mg/kg暴露组（2天）未发现任何DEGs。这表明NUCOP–M?的转录响应具有明显的浓度和时间依赖性。
**2. 聚类分析与主成分分析**
对DEGs进行的聚类分析和PCA显示，样本按暴露时间清晰分离（2天与21天相似度约9%）。在21天时，不同浓度样本间相似度较高（约65%），且表达水平呈剂量依赖性增加（500 mg/kg比100 mg/kg更显著）。PCA的第一主成分（PC1）解释了75.626%的数据方差，进一步证实了时间依赖性。
**3. 基因本体（GO）和KEGG通路分析**
基于富集分析标准，未发现显著的GO术语。KEGG通路分析显示，在21天暴露时，AMPK信号通路（ko04152）和N-聚糖生物合成通路（ko00510）接近显著（q值=0.2661）。AMPK通路中涉及细胞周期停滞的基因表达变化，与后续讨论的繁殖效应一致。
**总结讨论部分：**
研究人员指出，NUCOP–M?诱导的基因表达谱具有时间和剂量依赖性。短期暴露（2天）仅发现少量变化，其中编码非常规肌球蛋白I类1f（MYO1F）的基因上调，可能参与颗粒内化或细胞内运输。长期暴露（21天）下，下调基因包括编码半桥蛋白2（HMCN2）和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶25（STK25）的基因，前者与线虫的生殖缺陷相关，后者参与胚胎发育，其下调可能解释先前观察到的繁殖抑制（28天减少约90%，56天减少约50%）。上调基因包括编码葡萄糖调节蛋白75（GRP75）、胰岛素样生长因子I（IGF-1）和凋亡诱导因子2（AIFM2，亦称铁死亡抑制蛋白1 FSP1）的基因，这些均指向线粒体应激和氧化应激反应。研究人员认为，NUCOP–M?释放的铜离子随时间增加，诱导了线粒体功能障碍和氧化应激，而动物通过上调IGF-1和AIFM2尝试保护细胞，但不足以完全阻止繁殖损伤。值得注意的是，KEGG分析中AMPK信号通路受影响的表达模式暗示细胞周期停滞，与繁殖效应相符。此外，与铜基纳米农药Kocide?3000的研究相比，NUCOP–M?似乎更倾向于促进糖酵解，而非抑制。
**结论部分翻译：**
本研究揭示了基于碱式氯化铜的商用纳米制剂对土壤无脊椎动物非靶标物种的潜在毒性机制，这在文献中完全缺失。尽管在当前实验设计中，较高的转录响应出现在21天暴露后，但仍可检测到2天暴露时细胞运输的增加。NUCOP–M?似乎在基因水平直接影响胚胎发育。所识别的大部分转录响应与铜诱导的线粒体相关氧化应激的产生和反应有关。此外，本研究证实了在生物个体水平观察到的长期影响。
