《International Journal of Legal Medicine》：Identification of biogeographically informative microssatelite markers for Brazilian Cannabis sativa samples: a machine learning approach for forensic origin prediction
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摘要：在巴西，大麻（*Cannabis sativa*）是最常被贩运的非法药物，其供应链源自国内和国际来源，通常涉及复杂的贩运方法。针对巴西联邦警察（BFP）旨在铲除大规模种植园的执法行动，出现了替代性贩运策略，例如通过邮政服务寄送大麻种子用于室内种植。在当代
摘要：在巴西，大麻（*Cannabis sativa*）是最常被贩运的非法药物，其供应链源自国内和国际来源，通常涉及复杂的贩运方法。针对巴西联邦警察（BFP）旨在铲除大规模种植园的执法行动，出现了替代性贩运策略，例如通过邮政服务寄送大麻种子用于室内种植。在当代法医遗传学中，微卫星仍然是个体识别的金标准，并已在侦查情境中被认可为有价值的追踪工具。然而，目前可用的微卫星组合对于巴西样本的信息量并非最优。本研究旨在利用来自巴拉圭（PG）、哥伦比亚（CO）、大麻多边形（MP）地区以及构成国内贩运相当大比例的外国组（FG）商业品系的38份大麻样本的基因组数据，识别并评估用于来源追踪的高信息量微卫星。研究使用了机器学习（ML）特征选择（FS）技术与分类模型的多种组合。为此，在实施主坐标分析（PCoA）和层次聚类的同时，还考虑了用于评估分类模型性能的多种指标。总体而言，支持向量分类器（SVC）与不同FS策略的组合在预测样本来源方面表现出优越性能，仅使用9个SSR即实现了对所有样本的完美分类。这些标记在PCoA及其层次聚类中，也根据生物地理学来源有效区分了四组缴获样本。本研究成功识别了用于区分与重要贩运路线相关的大麻样本的信息性SSR标记。涉及新的、更大样本组的进一步研究对于验证其在实际侦查环境中的应用可能具有重要意义。
基于机器学习的巴西大麻微卫星标记鉴定及其法医来源预测研究解读
**研究背景与问题**
大麻（*Cannabis sativa*）作为一种兼具药用与 recreational 用途的植物，在全球范围内具有重要的社会和经济意义。在巴西，大麻类毒品是最广泛消费的非法药物，其非法市场供应呈现复杂的双源格局：约30%由国内“大麻多边形”（MP）地区种植供应，该区域位于伯南布哥州和巴伊亚州，涵盖13个城市；其余约70%则主要依赖巴拉圭边境地带（尤其是南马托格罗索州）的国际贩运输入。此外，面对巴西联邦警察（BFP）对大规模种植园的铲除行动，近年涌现出新的贩运策略，即通过邮政物流从邻国（如乌拉圭）乃至欧洲进口种子，用于难以侦查的小规模室内种植。因此，准确判定大麻样本的生物地理学来源，对于打击贩运网络、追溯毒品供应链具有重要意义。
当前，用于区分大麻样本地理来源的法医方法主要包括DNA条形码、SNP和微卫星等遗传标记的扩增，以及植物和土壤的多元素浓度分析。然而，这些方法存在显著局限：其一，现有研究使用的遗传变异组合多基于外国样本（多为欧洲或北美栽培品系）开发，缺乏针对巴西非法市场大麻样本的最优信息位点，导致需要更多标记才能实现区分，增加了成本与劳动强度；其二，某些材料类型（如种子、幼株或降解样本）不适于化学分析。微卫星（STR/SSR）作为当代法医遗传学的金标准，在人类个体识别和植物群体遗传学研究中广泛应用。近期研究虽然展示了机器学习（ML）策略在多种植物（大豆、水稻、咖啡、葡萄、玉米和拟南芥）中预测表型和复杂性状的效力，但在利用微卫星数据结合ML进行大麻来源追踪方面，尤其是针对拉丁美洲贩运路线，仍存在研究空白。基于此，研究人员利用微卫星标记结合多种ML策略，旨在确定与巴西麻醉品贩运路线相关的大麻样本的地理来源。
**研究内容与主要技术方法**
本研究分析了大麻样本的遗传数据，以开发高效、信息量高的微卫星标记组合用于来源预测。主要技术方法涵盖以下关键环节：
**样本队列来源**：研究涉及38份由巴西联邦警察提供的样本，分为四组：巴拉圭组（PG，n=8）和哥伦比亚组（CO，n=4）来源于2019-2022年邮政分拣行动中缴获的压缩大麻砖中的种子；大麻多边形组（MP，n=12）为2015-2019年现场行动缴获的叶片材料；外国组（FG，n=14）为2017年和2019年从邮政服务截获的多种外国商业品系种子经BFP种植所得叶片。
**DNA提取与测序**：使用DNeasy试剂盒提取DNA，并通过Illumina NovaSeq 6000平台进行250 bp双端测序，平均每样本获得8.3 × 10?条读数，所有样本Phred质量分数超过30。
**序列比对与SSR提取**：以NCBI数据库中的大麻参考基因组（GCF\_029168945.1，v.2.0，基因组大小770.3 Mb）为参考，使用Bowtie2进行比对（平均比对率90.465 ± 1.268%），经Samtools处理生成一致性序列，再利用SATIN程序进行SSR鉴定，最终获得467,527个SSR的原始数据集。
**特征选择（FS）策略**：采用四种策略生成SSR子集——组间保守SSR选择（GC-SSR，作为基准方法）、SelectKBest（基于ANOVA F值的过滤方法）、混合FS（结合SelectKBest、随机森林RF和递归特征消除RFE）以及LASSO（基于L1正则化的嵌入式方法）。
**分类模型**：对每个SSR子集评估三种分类算法——线性核支持向量分类器（SVC）、随机森林（RF）和梯度提升（GB），通过贝叶斯优化进行超参数调优，采用留一法交叉验证（LOOCV）评估性能。
**聚类分析**：基于Jaccard距离进行主坐标分析（PCoA）和UPGMA层次聚类。
**研究结果**
**特征选择结果**：GC-SSR策略经筛选后保留30个SSR（子集1），其中CO组独有9个、MP组独有6个、FG组独有4个，而PG组未发现组内保守SSR。SelectKBest和LASSO各选30个SSR（子集2和4），混合FS经RF-RFE选30个SSR（子集3）。不同子集间存在部分共享标记。
**分类性能**：在所有FS策略与分类模型的12种组合中，线性SVC表现最优，其中结合SelectKBest筛选的子集2仅需9个SSR即实现完美分类（F1分数=1.0）。GC-SSR子集配合GB模型也达到满分，仅需7个SSR。RF模型在各子集上表现良好但未达完美。GB模型整体性能波动较大，部分组合（子集2和4）仅略高于0.80。
**聚类分析**：基于SVC最优模型使用的9个SSR进行的PCoA分析中，前两个主坐标分别解释41.13%和16.54%的遗传变异，可清晰区分四组样本。层次聚类显示FG、MP和CO组形成明显独立簇，而PG组样本散布于各簇中，提示其内部遗传多样性较高。
**讨论与结论**
**特征选择策略的意义**：GC-SSR这一基于生物直觉的简单过滤方法在多数模型中表现出色，提示组内保守的微卫星可能位于具有功能重要性或进化保守性的基因组区域。相比之下，LASSO可能因过于激进的特征消除而丢失重要信息，混合FS方法则因复杂度较高，在小样本和类别不平衡的数据集中未必能发挥最优性能。
**分类模型与标记的解读**：线性SVC的卓越性能表明SSR标记提供了近乎完美的线性可分性，且该模型计算成本低、易于解释。最优9个SSR位于1号染色体的不同蛋白编码基因座，涉及逆境响应（CsNAC01）、泛素-蛋白酶体途径（E3泛素连接酶、F-box蛋白）、线粒体复合物I组装（NDUFAF1）以及未表征区域，可能反映了不同地理来源大麻对特定环境条件的适应性变异。
**PG组遗传异质性**：PG样本未显示组内保守SSR，需更多标记才能准确分类，提示该组遗传多样性较高，可能源于大规模“压砖”缴获品聚集了巴拉圭境内多个农场或地区的收获材料，形成高度混合的遗传特征。
**结论**：本研究成功鉴定了具有区分巴西非法市场相关贩运路线大麻样本能力的信息性SSR标记，其中线性SVC结合特征选择策略的9个标记组合最具预测价值。标记位于与植物环境适应和生理调控相关的基因区域，并有效区分了不同生物地理来源的样本。需要更大规模、更均衡的样本数据库来验证标记的实际鉴别效力，并优先使用来源文件完备的认证样本作为“金标准”。未来研究应在新的样本组中进行实验验证，并评估法医质量参数如随机匹配概率、排除能力和鉴别能力，以及群体分化指标（如\(F_{ST}\)），以推动这些标记在实际侦查中的应用。
