《ACS Omega》：Resonance Raman and Multivariate Curve Resolution-Alternating Least Squares (MCR-ALS) Analysis of Biological Polyenes in Shells: A Nondestructive Approach for Species and Habitat Identification
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贝壳等生物矿化材料中含有微量源自类胡萝卜素（carotenoids）的生物多烯（biological polyenes），这类物质在生物学、地球科学、环境科学和材料科学领域引起了广泛关注。此外，近期食用贝类产地 fraudulent labeling（欺诈性标
贝壳等生物矿化材料中含有微量源自类胡萝卜素（carotenoids）的生物多烯（biological polyenes），这类物质在生物学、地球科学、环境科学和材料科学领域引起了广泛关注。此外，近期食用贝类产地 fraudulent labeling（欺诈性标注）问题的出现，凸显了开发可靠的、无损的物种和产地鉴别方法的必要性。本研究中，研究人员将共振拉曼光谱（Resonance Raman spectroscopy）应用于无损检测不同物种和生长环境贝壳中的类胡萝卜素衍生多烯（生物多烯）。研究重点关注了约1500 cm-1和1120 cm-1处的谱带峰位和半高全宽（FWHM），分别归属于C═C和C–C伸缩振动。单点拉曼测量显示，不同样品的峰位和FWHM值均存在差异，表明每个贝壳中存在多种类型的生物多烯，且其分布取决于物种和产地。为进一步解析这些光谱特征，研究人员进行了多点（拉曼成像）测量，并应用多元曲线分辨-交替最小二乘（MCR-ALS）分析提取生物多烯的纯组分光谱。结果表明，每个贝壳中可识别出多种不同的多烯物种。特别值得注意的是，观察到的约1120–1100 cm-1处的谱带与典型类胡萝卜素的特征谱带存在差异，提示贝壳中的多烯根据物种和环境条件而变化。为更清晰地进行比较，研究人员将这些峰位划分为四个不同的组。综上所述，研究结果首次证明，无需提取或分离即可区分不同贝类物种和产地的生物多烯类型和数量。这一发现暗示贝类可能根据环境因素（如摄食条件）生物合成不同于类胡萝卜素的多种多烯。共振拉曼光谱与MCR-ALS的结合为生物矿化材料（如贝壳）的鉴别和表征提供了一种有效的方法。
## 研究背景与意义
生物矿化材料如贝壳是复杂复合材料，除主要无机成分外还包含微量元素和有机分子，这些组分受生长环境的影响显著。贝壳的物种特性和风味因生长环境而异，因此产地鉴别不仅具有科学意义，也对消费者和生产者至关重要。近年来，贝类产地的欺诈性标注成为多个国家面临的严重社会问题，亟需建立可靠的无损化学方法进行产地溯源。基因组分析（genome analysis）是目前主要使用的方法，虽能明确物种和遗传谱系，但无法提供产地信息。以往研究也考察了碳酸钙（calcium carbonate）晶体结构和同位素组成（isotopic compositions）以评估环境对贝壳形成的影响，但这些方法主要关注晶体基质而非微量有机成分。
生物多烯（biological polyenes）是嵌入贝壳中的另一类重要有机分子，通常以微量存在，主要在 brightly colored shells（ brightly colored shells）中受到关注。由于贝类无法从头合成多烯，其组织和贝壳中的所有生物多烯均被认为来源于从浮游生物中吸收的饮食类胡萝卜素。因此，贝壳中的多烯组成可能反映其摄食环境和产地。尽管已有研究分析了贝类中的生物多烯，但大多数研究针对软组织，且由于浓度低，通常需要提取或分离。为克服这些局限，研究人员旨在建立一种更简便的、无需提取的分析方法，用于表征不同物种和产地的贝类。
## 关键技术方法
本研究采用共振拉曼光谱（resonance Raman spectroscopy）结合多元曲线分辨-交替最小二乘（MCR-ALS）的方法。共振拉曼光谱利用532 nm激发光实现共轭多烯的强共振增强效应，无需任何预处理即可高灵敏度和选择性地检测。MCR-ALS是一种强大的化学计量学方法，用于将复杂数据集分解为纯组分光谱和浓度分布。为提取单个生物多烯的光谱，研究进行了多点多光谱成像采集：在各贝壳粉末样品上选定40 μm × 40 μm区域，以2 μm间隔进行规则网格扫描，每个数据集获取441条光谱。数据处理中，先应用中值滤波、基于奇异值分解（SVD）的主成分分析（PCA）降噪和基线校正，再进行MCR-ALS分解。非负性约束施加于浓度和光谱矩阵，不设单峰性和闭包约束。通过信号噪声比（S/N）>10的标准确定有效组分数目。所有数据集采用相同处理流程以确保一致性。样本来源包括：日本滋贺的河蚬（Corbicula sandai）、中国的河蚬（C. fluminea）、日本青森·茨城·岛根·鸟取四个产地的日本蚬（C. japonica，半咸水）、日本北海道·三重及韩国的菲律宾蛤仔（Ruditapes philippinarum，河口潮间带）、以及智利·新西兰·日本宫城的紫贻贝（Mytilus galloprovincialis，海水或半咸水）。
## 研究结果
### 单点拉曼测量
研究人员对涵盖不同物种和产地的12个贝壳样品进行单点拉曼光谱测量，采集范围为2000–100 cm
-1。除碳酸钙（文石型约1085、705、205、152 cm
-1；方解石型约1085、710、280、155 cm
-1）及低波数区晶格振动模式外，在约1500、1300、1120和1020 cm
-1 height="20">处观察到多烯相关谱带，分别归属于C═C伸缩、C–H弯曲、C–C伸缩和C–CH3摇摆振动模式。这些谱带因共振拉曼效应而显著增强。聚焦约1500 cm-1（C═C伸缩）和1120 cm-1（C–C伸缩）两条最突出的多烯谱带，研究人员发现不同样品间存在明显的峰位和半高全宽（FWHM）差异，无需提取或分离即可区分物种依赖的光谱差异。紫贻贝样品显示C═C伸缩频率较其他两个物种低约15 cm-1；多数河蚬和菲律宾蛤仔样品在1505和1125 cm-1附近出峰，但滋贺河蚬和茨城日本蚬的峰位高约10 cm-1。FWHM的变化同样显著。这些结果表明贝壳内多种生物多烯共存，其分布反映物种和产地差异。
### MCR分析
表1中的FWHM值和图2的光谱轮廓明显宽于典型类胡萝卜素（如β-胡萝卜素），且多烯相关谱带出现肩峰，强烈提示存在多个重叠组分。研究人员尝试二阶导数和曲线拟合方法未能获得超越表1总结的信息，且单点测量无法排除局部光谱非均质性。为此，研究人员从每个样品采集多点光谱并应用MCR-ALS提取对应多烯的纯组分光谱。以R. philippinarum（三重）为例提取到三种不同的多烯衍生组分，而同一物种的R. philippinarum（北海道）仅提取到一种组分；M. galloprovincialis（宫城）则提取到三种组分，但其峰位与R. philippinarum（三重）不同。这些结果证明组分的数目和光谱特征均随物种和产地而变化。据研究人员所知，此前尚无研究成功利用MCR-ALS从贝壳光谱中提取多种生物多烯组分，本研究首次通过共振拉曼光谱与MCR-ALS的结合，详细鉴定了贝壳中的多种生物多烯。
### 生物多烯分析
为深入理解上述结果，研究人员考察了单点光谱或MCR提取组分的峰位是否能直接与浮游植物中类胡萝卜素的峰位比较。观察到的C–C伸缩振动峰位出现在1120–1100 cm-1区域，比典型类胡萝卜素的约1150 cm-1低20 cm-1以上，表明直接比较困难。研究人员尝试仅用有机溶剂提取、不脱钙处理，发现多烯不进入溶剂层而残留于贝壳粉末中，提示多烯与碳酸钙或蛋白质存在强物理或化学相互作用。Barnard和Waal报道的峰移源于与蛋白质或矿物基质的相互作用以及甲基取代、异构化和共轭链构象变化，但其研究中脱钙多烯与原生贝壳多烯的峰移仅达9 cm-1，无法解释本研究中超过20 cm-1的峰移。相比之下，Okamoto等报道的19,19′,20,20′-四去甲-β,β-胡萝卜素（demethylated β-carotene，脱甲基β-胡萝卜素）的C–C伸缩带较β-胡萝卜素低移约20 cm-1，且约1000 cm-1处的C–CH3摇摆带几乎消失，与本研究中该带明显弱于典型类胡萝卜素的观察高度一致，强烈暗示贝类正在修饰类胡萝卜素，很可能通过脱甲基化实现。因此，贝壳中生物多烯的共振拉曼光谱无法直接与典型类胡萝卜素比较，其峰位受蛋白质-碳酸钙相互作用及脱甲基化等多种因素影响，但这些修饰清晰反映于光谱中并可能与产地相关。
基于以上认识，研究人员比较了未经任何提取过程获得的光谱。通过MCR提取组分的C═C和C–C伸缩峰位分析，研究人员尝试将共轭长度与峰位关联，但发现部分值与典型类胡萝卜素的11个共轭双键明显偏离，表明仅基于共轭长度的表征不适用。进而，研究人员将峰位分为四组（A–D，间隔约10 cm-1）：A组（1525–1515/1135–1128 cm-1）、B组（1512–1502/1127–1116 cm-1）、C组（1500–1490/1115–1105 cm-1）和D组（1489–1480/1100–1090 cm-1）。结果显示：所有菲律宾蛤仔和河蚬物种含B组多烯，所有紫贻贝含D组多烯；A组见于部分菲律宾蛤仔和河蚬物种，C组见于某些日本蚬和紫贻贝样品。这种分组分析揭示了贝壳中生物多烯的物种特异性特征和产地依赖性变异。
研究人员也尝试了聚类分析（clustering）和判别分析（discriminant analysis）等统计分类方法，但由于样本量有限且光谱特征峰位接近，未能获得统计上稳健或可重复的分类结果，提示在此条件下统计分类具有挑战性。相比之下，峰位分析反映的多烯分子结构信息（有效共轭长度和化学修饰）更为可靠。
## 讨论与结论总结
本研究通过共振拉曼光谱结合MCR-ALS，成功在无损、近原生条件下检测了贝壳中的多种生物多烯，建立了区分不同物种和产地生物矿化材料的新方法。结果明确证明，共振拉曼光谱与MCR-ALS的结合可用于无需化学提取或分离即可鉴别各种贝壳中不同生物多烯的存在，并将差异与贝类物种及其生长环境相关联。
单点拉曼光谱已能揭示不同样品间的峰位和FWHM差异，但重叠带的详细解读受限。MCR-ALS的应用成功解析了肩峰并提取多种纯组分光谱，其数目和位置随样品变化，证实了该联合方法对含生物矿化材料表征的有效性。研究也表明，直接比较贝壳多烯与类胡萝卜素的光谱存在困难，原因包括与蛋白质和碳酸钙基质的相互作用以及脱甲基化等化学修饰。为此，研究将光谱按峰位分为四组，成功区分了物种和产地依赖的光谱特征，提供了一种简便有效的贝类表征策略。
该方法论预期将为未来贝类产地和生长环境研究做出贡献，特别是与碳酸钙基质分析相结合时。研究发表于《ACS Omega》。
