《ACS Sensors》：Detection of Anti-Mycobacterium leprae Antibodies in Leprosy Contacts Using a Label-Free Approach with the Heat-Transfer Method
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本文介绍了一种创新的热传导方法（HTM）生物传感器，它采用新型多表位蛋白受体，能够无标记地检测人血清中抗麻风分枝杆菌抗体。研究首次证明了热生物传感平台在临床相关场景（如麻风病接触者筛查）中检测特异性抗体的可行性。该策略有望成为一种灵敏、低成本的即时检测（POC）工具，用于麻风病早期发现与接触者监测，为解决识别感染与无症状携带者的关键诊断挑战提供了新思路。
材料与方法
化学品与试剂
研究所用的铝片购自Conrad Electronic（德国）。其他化学品，如氢氧化铵（NH4OH）、过氧化氢（H2O2）、(3-氨丙基)三乙氧基硅烷（APTES）、戊二醛、牛血清白蛋白（BSA）、山羊抗人IgG、IgM和IgA-HRP、硫酸（H2SO4）购自Sigma-Aldrich。乙醇和甲苯购自Biosolve。磷酸盐缓冲盐水购自PanReac AppliChem。Tween 20购自Fisher Chemical。3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（TMB）和抗人IgA/IgM/IgG-FITC购自Invitrogen, Thermo Fisher Scientific。Costar 96孔板购自Corning Inc.。本研究使用的重组蛋白（序列：LTPLSTTSGGKGKPTPNSTASVGKGKSNTPVASSGGKGKSSRIDLTVAGKGKVSTPTGSTA）在实验室中表达和纯化，该构建体源自本课题组先前描述的肽段，这些肽段在ELISA中与麻风病接触者血清显示出有前景的反应性。
人血清样本
本研究中纳入了来自巴西个体的血清样本，样本来源于寄生虫免疫生物学与控制实验室（LICP-UFMG）的生物样本库。所有参与者均匿名，并在样本采集前提供了书面知情同意。麻风病接触者的定义基于其指示病例（索引病例）的麻风病诊断，该诊断由各自医疗机构的专科医生根据世界卫生组织（WHO）的操作分类进行：多菌型（MB）和少菌型（PB）。结核病基于临床标准诊断。研究方案经米纳斯吉拉斯联邦大学伦理委员会批准，并根据巴西国家卫生委员会的指导方针进行。本研究使用了七份麻风病接触者（暴露于麻风分枝杆菌）、六份阴性对照（未暴露）和一份结核病患者的血清样本。
酶联免疫吸附试验（ELISA）
采用常规ELISA检测针对设计蛋白的特异性免疫球蛋白。血清样本按1:400、1:200、1:133、1:100和1:80稀释于含0.5% BSA的PBS中进行检测。使用辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗人IgA、IgM和IgG（在含0.5% BSA的PBS中稀释1:10,000）作为二抗。实验按照先前描述的方案进行，使用TMB作为底物，并在450 nm波长下读取光密度值。
铝芯片的生物功能化
将铝片切割成芯片（1 × 1 cm，厚度0.5 mm）。首先将芯片浸入碱食人鱼溶液（NH4OH:H2O2, 3:1, 20%）中搅拌45分钟，以生成羟基化表面。随后，用乙醇和去离子水彻底冲洗芯片各三次，并用氮气流干燥。硅烷化过程采用甲苯中2%的APTES在70°C气相条件下进行60分钟，随后在热板上干燥1分钟，再用氮气流干燥。芯片接着用50%戊二醛（pH 7.4）在室温下处理15分钟，然后用去离子水彻底冲洗。通过将芯片浸入10 μg/mL蛋白质溶液（溶于PBS）中60分钟来实现蛋白质固定，随后用PBS-T（含0.05% Tween 20的PBS）洗涤。为了阻断非特异性结合，芯片在含5% BSA的PBS中孵育，然后从封闭液中取出，转移至HTM流动池或用于后续的ELISA或共聚焦显微镜分析。
生物功能化表面的表征
傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析
使用配备衰减全反射（ATR）晶体的光谱仪在吸收模式下获取铝表面的FTIR光谱。测量参数：光谱分辨率16 cm?1，扫描200次，Happ-Genzel切趾函数，波数范围400?4000 cm?1。
能量色散X射线光谱（EDX）分析
使用配备EDX探测器的场发射扫描电子显微镜分析铝表面的元素组成。测量在二次电子检测（SED）模式下进行，着陆电压10.0 kV，工作距离10.0 mm，高真空下放大倍率×2000。加速电压设为10.0 kV，活时间100.00秒，实时间101.46秒。死时间保持在1.0%，计数率为每秒3959次计数。使用标准无ZAF方法对数据进行量化。
ELISA类似法与共聚焦显微镜
生物功能化后，为确认功能性蛋白质结合，将芯片与用0.5% BSA（PBS中）稀释1:100的人血清样本，或仅含0.5% BSA的对照液，在37°C下孵育60分钟。随后用PBS-T洗涤并加入二抗。
对于ELISA类似法，应用山羊抗人IgA、IgM和IgG-HRP二抗（在0.5% BSA中稀释1:10,000）于37°C孵育60分钟。PBS-T洗涤后，加入TMB底物，室温避光孵育15分钟。加入1 M H2SO4终止反应，并使用紫外-可见分光光度计测量液体在450 nm处的吸光度。
对于共聚焦显微镜，芯片与抗人IgA/IgM/IgG-FITC二抗（在0.5% BSA中稀释1:15,000）在4°C下孵育过夜。使用配备蔡司Axiocam 705单色相机的蔡司Axio Observer 7倒置显微镜进行荧光成像。使用5倍/0.16 NA EC Plan-Neofluar空气物镜，像素分辨率为0.69 × 0.69 μm。用469 nm LED（20%强度）激发FITC标记的抗体，通过四波段带通滤光片收集发射光。图像曝光时间为150毫秒，并使用ImageJ（Fiji）处理。
用于检测抗麻风分枝杆菌抗体的热传导方法（HTM）测量
生物传感器的配置如前所述。简言之，将生物功能化的铝芯片安装在铜块热源上，受体层面向流动池。铜块温度通过K型热电偶持续监测，并通过由功率电阻器和基于LabVIEW软件的比例-积分-微分（PID）控制器组成的温控系统维持在37°C。流动池内液相温度由位于识别层上方1 mm处的第二个K型热电偶测量。聚碳酸酯流动池的内部容积为110 μL，功能化芯片与密封O型圈之间的接触面积为28 mm2。通过注射泵控制含目标抗体的血清样本注入装置。首先用0.5% BSA对流动池进行条件化，并使系统平衡30分钟。为了捕获对应于芯片上抗体结合逐步增加的热响应，每个血清样本以五个连续注射周期引入流动池。样本初始稀释度为1:400，每个周期包括5分钟的注入和20分钟的热稳定。每个周期后，注入相同稀释度（1:400）的新等分试样血清，置换流动池中的先前内容，从而有效增加受体层上目标物保留的累积浓度。经过五个周期，有效的血清稀释度分别约为1:400、1:200、1:133、1:100和1:80。在整个测量过程中，温度被持续监测。使用配备风扇的隔离箱来维持测量环境的稳定温度，并确保流动池内观察到的温度变化不受周围环境波动的影响。
统计分析
使用Origin 2025和GraphPad Prism 10进行统计分析。计算效应量以评估组间观察到的差异大小。阈值由平均值加三倍标准差确定。对于每次添加，计算稳定后的温度平均值，并计算效应量以反映相对于基线的百分比变化。所有测量均进行独立的三次重复实验。还包含了仅含BSA的对照以评估背景信号。
结果与讨论
ELISA
ELISA结果显示，在测试样本中，针对该蛋白的特异性IgG、IgA和IgM均存在，并且这些免疫球蛋白的水平随着血清浓度增加而升高。接触者血清样本仅在确认指示病例诊断后采集，表明采样前暴露于麻风分枝杆菌可能已持续相当长时间。由于与其他免疫球蛋白类别相比，血清IgA反应通常是早期且短暂的，因此在此阶段IgA水平可能已经下降。因此，尽管生物学差异可能仍然存在并应予以考虑，但组间对于该免疫球蛋白可能未观察到统计学上的显著差异。接触者中观察到显著高于阴性对照的IgM和IgG水平，这与先前研究的结果一致。这些结果证实了该队列中存在针对该抗原的多种免疫球蛋白类别。
蛋白质生物功能化铝芯片的表面表征
通过FTIR、ELISA类似法和共聚焦荧光成像对生物功能化芯片进行了表征。FTIR光谱显示裸铝表面与生物功能化表面存在差异。生物功能化后，表面在~3400 cm?1附近出现宽谱带，对应O?H伸缩振动，表明活化后表面存在羟基。在~2970 cm?1和~2880 cm?1处出现新的吸收谱带，对应C?H伸缩振动，以及在~1630 cm?1、~1560 cm?1和~1300 cm?1处出现强谱带，分别属于酰胺I带、酰胺II带和酰胺III带振动。这些光谱变化表明蛋白质分子存在于表面，确认了生物功能化成功。通过EDX进一步评估功能化，揭示了裸表面与生物功能化表面之间的元素差异。
在类似条件下进行两种互补测定以直观确认生物功能化成功，并评估平台上重组蛋白以其生物学功能形式存在的情况：ELISA类似法和共聚焦荧光成像。两种测定均比较了与阴性对照孵育的生物功能化芯片，以及与之前显示能识别固定蛋白抗体的人血清孵育的芯片。
对于ELISA类似法，与阴性对照血清孵育的芯片在450 nm处的吸光度分别为：IgA 0.190，IgM 0.199，IgG 0.193；而与麻风病接触者血清孵育的芯片显示出更高的平均吸光度值，分别为0.284、0.296和0.305，表明抗体结合增加。在荧光测定中，麻风病接触者样本观察到的信号约为阴性对照的两倍，平均强度值分别为20,741和9830，表明抗体与功能化表面的结合增加。这些结果表明蛋白质已成功固定在芯片上，并保留了结合人样本中抗体的能力，证明相关表位在固定后仍可及。此外，它们证实了除IgG外，其他免疫球蛋白类别也能与蛋白质结合并可同时被检测。
热传导方法（HTM）测量
使用材料与方法部分描述的微流体流动池中的热传导方法，评估了所得功能化芯片定量人血清中抗麻风分枝杆菌抗体的能力。首先使用0.5% BSA溶液填充微流体室并使系统达到平衡温度，以建立定量实验的基线。随后用0.5% BSA中稀释1:400制备的人血清样本替换缓冲液。重复注入过程，并使用位于芯片上合成受体上方的热电偶实时监测温度。
渐进式抗体结合实验
研究显示了当蛋白质（合成受体）包被的芯片暴露于与麻风病患者密切接触者血清和未接触者血清时，观察到的代表性原始温度信号。对于暴露于麻风分枝杆菌的样本，温度随时间下降更为明显，这与抗麻风分枝杆菌抗体与固定蛋白质的特异性结合一致。结合后，目标抗体抑制了从铜块到腔内液体的热流。使用在先前ELISA中光密度值低于和高于阈值的未暴露和已暴露样本来构建校准曲线。结果表明，当合成受体与暴露于麻风分枝杆菌样本中存在的目标抗体相互作用时，传感器的响应更好。暴露样本在最终添加时产生的效应量是未暴露样本的四倍，证实了观察到的响应可归因于固定蛋白质和血清中特异性抗体的存在。相比之下，未暴露样本的响应接近传感器噪声水平，表明芯片上抗体结合极少或无法检测到。在第五次注入稀释血清后，所有样本的信号均略有增加，这可能是由于其他血清成分的非特异性沉积。
选择性
使用一份结核病患者的人血清样本来评估受体层的选择性。结果显示，该装置对暴露于麻风分枝杆菌的血清的效应量约为结核病样本的三倍。这种显著差异可归因于特异性抗体识别的基本机制，该机制依赖于分析物与固定受体之间的生化相互作用。与校准类似，结核病血清产生的响应接近传感器噪声，在第五次注入后信号增加，这强化了抗体与芯片结合极少或没有的观点，并表明后期信号是由于更高浓度下血清成分的非特异性沉积。
概念验证实验及与额外临床样本的ELISA
鉴于测试血清样本中针对该新型蛋白的抗体浓度未知，研究的主要目标是确定是否存在能够与固定蛋白质结合的抗体。在传染病诊断背景下，定性检测最为相关，因为确认特异性抗体的存在足以指示病原体暴露并指导治疗和公共卫生政策。为此，将五个阴性对照样本的平均信号加上三倍标准差设定为阳性阈值。用传感器测试了六名不同麻风病患者密切接触者的样本。信号高于阈值的被归类为阳性，低于阈值的被归类为阴性。
结果显示，校准和选择性测试后测试的额外暴露样本在第二次或第四次注射后超过了阈值。这在先前分类为MB或PB接触者的样本中均有观察到，表明即使在高于其他麻风病ELISA检测中使用的血清稀释度下也能产生阳性响应。这表明，尽管抗体与通常用热传导方法测试的较大病原体相比尺寸较小，但基于热传导的生物传感器可以在与ELISA相当甚至更低的血清稀释度下检测到特异性抗体结合。这种性能可能与传感器的无标记特性有关，该特性允许同时检测结合到表面的多种免疫球蛋白类别，这一点得到了常规ELISA、ELISA类似法和共聚焦荧光结果的支持。相比之下，仅含BSA的测量值保持在传感器噪声水平以下，确认了基质对热传导信号的贡献可忽略不计。值得注意的是，抗麻风分枝杆菌抗体水平通常非常低，这证明我们的平台足够灵敏，能够检测到微量的抗体。尽管抗体数量对于治疗或控制措施并非临床决定性因素，但分析灵敏度对于在低抗体滴度样本中区分真实的结合事件至关重要，从而降低假阴性反应的可能性。这一观察结果也表明，对于循环抗体水平通常较高的疾病，例如利什曼病或虫媒病毒感染，该平台的分析性能可能会进一步增强。
综合来看，研究结果表明HTM有潜力以无标记方式同时检测不同的免疫球蛋白类别，从而能够开发泛Ig检测策略，这可能比ELISA等其他血清学测试成本更低、步骤更少。这种检测策略尤其重要，因为在暴露于麻风分枝杆菌后，抗体反应逐渐且异质地发展，不同的免疫球蛋白类别可能在临床疾病发作前的不同时间点变得可检测。有证据表明，IgM与IgG和/或IgA联合检测呈阳性的接触者感染和疾病进展的风险更高，这强调了在接触者监测中进行泛免疫球蛋白筛查的重要性。个体间抗体水平的差异可能反映了暴露持续时间、宿主免疫反应或自初始感染以来时间的差异。此外，先前研究表明，MB患者的接触者往往呈现更高的抗体负荷，这与我们观察到的趋势一致。由于每个血清样本来自单个接触者，根据其指示患者分类，同一份样本内同时存在PB和MB抗体反应的情况并不预期。目前，巴西使用基于酚糖脂-I（PGL-I）抗原的血清学检测进行接触者追踪。然而，根据制造商信息，其临床验证是针对患者而非接触者进行的。有证据表明，一些在该血清学检测中呈阴性的接触者仍然表现出未暴露个体中未观察到的细微感觉改变，这表明该血清学工具可能不足以进行有效的接触者监测。在此背景下，需要新的策略来提高检测准确性，例如本研究提出的方法。一些作者建议对发病风险最高的个体（如接触者，包括儿童）进行预防性干预。
此外，研究结果表明，暴露于麻风分枝杆菌可能不仅限于与确诊患者直接接触的个体。关于人畜共患传播（尤其涉及犰狳）的报告表明，接触这些潜在宿主的个体也可能面临风险，但通过常规的指示病例追踪仍无法检测到。检测无症状个体中抗麻风分枝杆菌抗体的另一个潜在应用是识别来自流行地区的感染者，特别是献血者中的识别。虽然本研究未直接评估此应用，但在临床健康个体中进行血清学抗体检测可能有助于识别无症状携带者，并降低通过血液传播等途径传播的风险。
将麻风病接触史、潜在非人类宿主暴露情况，以及可行的敏感血清学检测整合到监测方案中，可以显著加强疾病控制工作，这与世界卫生组织到2030年阻断传播的目标相一致。因此，在症状出现前检测麻风分枝杆菌感染仍然是麻风病的关键诊断挑战之一。本研究开发的生物传感器显示出解决这一诊断空白的巨大潜力，但将其转化为实际应用需要进一步优化传感层和电子信号处理、大规模验证以及设备小型化，以便集成到即时检测平台中。
结论
本研究成功开发了一种基于热传导的无标记生物传感器，该传感器采用新型多表位蛋白功能化，能够直接在人血清样本（相比缓冲液更具挑战性的基质）中检测抗麻风分枝杆菌抗体。未来的研究应优先对检测呈阳性的个体进行纵向随访，以评估健康结果并识别早期临床体征，从而阐明该方法的预测价值。将生物传感器信号与生物样本中的麻风分枝杆菌DNA水平相关联，可能进一步阐明抗体检测与细菌负荷之间的关系，从而加强诊断准确性。除了麻风病，该生物传感器平台有望适应于其他传染病，为早期诊断和流行病学监测提供多功能解决方案。总之，这些策略可以改变早期检测方式，支持预防性干预，并加强全球疾病控制工作。
