CD8+T细胞通过ROS/TGF-β-IRF4通路调控CD39+诱导性调节性T细胞分化，增强自身免疫炎症抑制功能

《Journal of Biomedical Science》：TGF-β signaling mediates crosstalk between CD8+ T cells and CD39+ induced Treg cells in autoimmune inflammation

这项研究揭示了CD8+T细胞在自身免疫调控中的新角色。研究发现，幼稚型CD8+T细胞能够通过ROS/TGF-β信号轴，依赖转录因子IRF4，促进CD4+诱导性调节性T细胞（iTregs）分化为具有高表达CD39、CD103、CTLA-4和Helios的功能增强亚群。该CD39+iTregs表现出更强的免疫抑制能力和稳定性，在结肠炎和自身免疫性关节炎模型中均展现出优越的治疗效果。这为优化基于Treg的自身免疫病疗法提供了新的策略和机制见解。

　　

引言

自身免疫性疾病，如炎症性肠病（IBD）和类风湿关节炎（RA），其特征是免疫系统失调。致病性Th1/Th17细胞通过产生IFN-γ和IL-17A等细胞因子驱动炎症和组织破坏。调节性T细胞（Treg， CD4⁺Foxp3⁺）对于维持免疫耐受和抑制过度免疫反应至关重要，其功能依赖于多种分子，如CTLA-4、CD39、TGF-β等。然而，在复杂的炎症微环境中，Treg的稳定性常受到挑战。CD8⁺T细胞与多种器官特异性自身免疫病密切相关，但其对CD4⁺Treg细胞的调节作用尚不清楚。本研究旨在探究CD8⁺T细胞对诱导性Treg（iTreg）分化、功能和稳定性的影响及其机制。

CD8⁺T细胞选择性增强CD4⁺iTreg体外功能

与从纯化幼稚CD4⁺T细胞诱导的iTregs相比，从脾细胞诱导的iTregs虽然Foxp3⁺细胞比例略低，但关键功能分子CD39、Helios、CTLA-4和CD103的表达水平显著更高，提示脾脏微环境中存在其他细胞亚群参与增强iTregs的功能表型。通过将不同脾细胞亚群与幼稚CD4⁺T细胞共培养发现，仅幼稚CD8⁺T细胞能显著提高iTreg细胞中CD39⁺、Helios⁺、CTLA-4⁺和CD103⁺亚群的频率，并增加Foxp3⁺细胞的绝对数量。这些由CD8⁺T细胞“启动”产生的iTregs（定义为CD4-8 iTregs）在体外表现出剂量依赖性的、更强的抑制T细胞增殖的能力。分析显示，无论是体外诱导的iTregs还是体内来源的自然Tregs（nTregs），其CD39^high亚群都高表达CTLA-4、Helios和CD103，提示CD39是Treg功能的关键标志物。共培养系统中的CD8⁺T细胞自身高表达CD103，且几乎不产生炎症因子，表明其可能向调节性表型转化。这种促进作用依赖于CD8⁺T细胞的数量及其活化状态，幼稚状态（CD62L⁺CD44^-）的CD8⁺T细胞促进作用最强，而效应或记忆样表型的促进作用减弱。

CD8⁺T细胞增强CD4⁺iTreg体内分化与功能

在T细胞转移性结肠炎模型中，共同过继转移幼稚CD8⁺T细胞和幼稚CD4⁺T细胞，能显著减轻由幼稚CD4⁺T细胞单独诱导的结肠炎，表现为体重下降减少、结肠病理损伤减轻，并抑制了CD4⁺T细胞中Th1（IFN-γ⁺）和Th17（IL-17A⁺）细胞因子的分泌。机制上，CD8⁺T细胞共同转移显著促进了体内CD4⁺Foxp3⁺iTreg细胞的生成，并提高了iTreg群体中Helios⁺、CTLA-4⁺、CD39⁺和CD103⁺细胞的比例。重要的是，记忆型CD8⁺T细胞不具备此保护作用，其共转移反而会加剧炎症。对溃疡性结肠炎患者单细胞转录组数据的分析进一步支持了CD8⁺T细胞与Tregs之间存在活跃的相互作用，且在疾病活动期，这种互作信号通路增强，与Treg的扩增呈正相关。

CD4-8 iTregs在结肠炎模型中展示更强的功能和稳定性

为了直接评估CD4-8 iTregs的治疗潜力，研究者在诱导结肠炎后，分别过继转移由CD4⁺T细胞单独或与CD8⁺T细胞共培养后分选出的Foxp3⁺iTregs进行治疗。结果显示，两种iTregs均能缓解结肠炎，但CD4-8 iTregs展现出更优越的疗效：小鼠体重下降更少，结肠肿胀和病理评分更低，脾脏、淋巴结和肠系膜中淋巴细胞扩增及结肠免疫细胞浸润更少。CD4-8 iTregs能更有效地抑制脾脏和淋巴结中的Th1和Th17反应，并更显著地增加Foxp3⁺Tregs的比例。稳定性分析发现，在炎症环境下，传统的iTregs体内Foxp3表达快速丢失，而CD4-8 iTregs能维持更高的Foxp3和CD39表达比例。在体外炎症刺激（抗CD3/CD28加IL-6）下，CD4-8 iTregs也更能维持Foxp3表达，并且更不易获得IL-17A的表达，显示出更强的谱系稳定性。

CD8⁺T细胞通过ROS/TGF-β信号轴增强iTreg中CD39⁺亚群比例

RNA测序分析显示，与CD4⁺T细胞单独诱导的iTregs相比，CD4-8 iTregs中与Treg免疫抑制功能相关的基因（如CD103、CD39、LAG3、TIGIT等）以及与细胞迁移相关的基因（如CXCR3、CCR2）表达上调。Transwell实验表明，CD8⁺T细胞的促进作用依赖于细胞间的直接接触。由于CD39和CD103均受TGF-β信号调控，研究者推测CD8⁺T细胞可能通过增强TGF-β信号来上调CD39。实验证实，使用抗LAP（潜伏相关肽）抗体阻断内源性TGF-β活化，能显著逆转CD8⁺T细胞对iTreg中CD39⁺比例的提升作用。在共培养系统中，CD4⁺T细胞上的LAP、整合素αvβ8（由Itgav和Itgb8编码）和GARP的表达均显著增加，表明CD8⁺T细胞促进了CD4⁺T细胞自身LAP的呈现和活化机制。同时，CD8⁺T细胞显著提高了共培养系统中CD4⁺iTregs和CD8⁺T细胞自身的活性氧（ROS）水平。使用ROS清除剂NAC处理，不仅能逆转CD39的上调，还会削弱iTregs在炎症刺激下Foxp3表达的稳定性，并减少Smad3的磷酸化及下游转录因子Sox4的表达。这些结果表明，CD8⁺T细胞通过促进ROS生成，进而增强LAP的切割和TGF-β信号活化，最终通过Smad3-Sox4轴驱动CD39等功能分子的表达。

CD8⁺T细胞中IRF4的表达对其调控iTreg生成至关重要

转录因子IRF4对Treg和CD8⁺T细胞的功能都至关重要。研究发现，Irf4^-/-小鼠体内Treg比例及Treg中CD39⁺比例均降低。在体外，CD4⁺T细胞缺失IRF4会损害iTreg分化，但不影响CD39比例；然而，当与IRF4缺陷的CD8⁺T细胞共培养时，野生型CD4⁺T细胞无法诱导出高比例的CD39⁺iTregs。机制上，IRF4缺陷的CD8⁺T细胞产生的ROS水平降低，导致共培养系统中CD4⁺iTregs的p-Smad3信号减弱。在体内结肠炎模型中，与Irf4^-/-CD8⁺T细胞共转移的小鼠，比与野生型CD8⁺T细胞共转移的小鼠疾病更严重，表现为体重下降更多，结肠炎症评分更高，Th1/Th17反应增强，而Tregs以及Tregs内的CD39⁺和CTLA-4⁺亚群比例则显著降低。这证明CD8⁺T细胞中的IRF4对其通过ROS/TGF-β通路调控iTreg功能是必需的。

CD8⁺T细胞增强CD4⁺iTregs在自身免疫性关节炎中的治疗潜力

为了探索临床转化前景，研究者在胶原诱导性关节炎（CIA）模型中测试了CD4-8 iTregs的疗效。与传统的iTregs相比，过继转移CD4-8 iTregs能更有效地降低关节炎临床评分和关节组织病理学评分。治疗组小鼠脾脏和淋巴结中的Treg群体得以维持，而致病性的Th1和Th17细胞比例则显著下降。这表明CD8⁺T细胞启动的iTregs在另一种自身免疫病模型中同样具有优越的治疗潜能。

讨论与结论

本研究首次系统阐述了CD8⁺T细胞对CD4⁺iTregs的正向调控作用。幼稚CD8⁺T细胞通过直接的细胞接触，依赖其内部的IRF4转录因子，提升共培养体系的ROS水平。ROS进而促进CD4⁺T细胞表面LAP的切割和TGF-β信号的活化，通过增强的Smad3磷酸化及Sox4表达，最终驱动产生一个高表达CD39、CD103、CTLA-4和Helios的、功能更强且更稳定的iTreg亚群。这种“CD8⁺T细胞启动”的iTregs在结肠炎和关节炎两种自身免疫疾病模型中，均展现出比常规iTregs更强大的抑制炎症和疾病进展的能力。该研究揭示了一条全新的CD8⁺T细胞与Tregs之间的免疫调节轴（ROS/TGF-β-IRF4），不仅深化了对Treg生物学和免疫稳态调控网络的理解，也为开发下一代基于Treg的细胞疗法——即利用CD8⁺T细胞预先“赋能”iTregs——提供了坚实的理论依据和 promising 的策略方向。