冻干型逆转录重组酶辅助扩增法：一种用于现场即时检测麝香鸭呼肠孤病毒的快速可视化技术

《Transboundary and Emerging Diseases》：Rapid and Visual Detection of Muscovy Duck Reovirus Using a Reverse Transcription Recombinase-Aided Amplification Assay in a Lyophilized Format for Point-of-Care Applications

本研究开发了一种靶向MDRV σC基因的冻干型RT-RAA检测方法。该方法在39°C下20分钟内可检测到低至1.03 × 101拷贝/μL的病毒RNA，与RT-qPCR灵敏度相当。其特异性高，无交叉反应，并成功实现了冻干制剂化，成为首个报道的此类冻干型RT-RAA方法。经42份临床样本验证，其与RT-qPCR一致性极高(κ = 0.952)，且可通过便携式蓝光成像仪进行裸眼判读。这为资源有限地区的MDRV现场监测提供了一种稳健、快速且用户友好的实用工具。

　　

1. 引言

麝香鸭呼肠孤病毒（MDRV）是一种危害家禽养殖业的病毒，主要感染40日龄以内的雏鸭，导致腿无力、生长迟缓和腹泻等症状，剖检可见肝脾有典型的灰白色坏死灶。该病毒对免疫器官具有强亲和力，能破坏免疫系统，造成免疫抑制。自1997年在中国出现以来，已成为地方性流行，给养鸭业带来巨大经济损失。

传统的MDRV诊断方法包括病毒分离、间接免疫荧光（IFA）、间接酶联免疫吸附测定（ELISA）以及常规和实时逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）。这些方法虽然可靠，但往往需要专业设备、技术人员和较长的处理时间，限制了它们在现场环境中的应用。因此，迫切需要一种快速、灵敏且适合现场使用的诊断工具。

重组酶辅助扩增（RAA）是一种创新的核酸等温扩增技术，非常适合现场即时检测（POCT）。它在恒定的较低温度（通常为37至42°C）下工作，可在10-20分钟内完成扩增，无需热循环，对样品中的抑制剂有高耐受性，且无需冷链储存，特别适合在偏远地区部署。本研究开发了一种靶向MDRV σC基因的实时逆转录RAA（RT-RAA）检测方法。该方法经过系统优化和严格评估，并首次建立了基于RT-RAA的MDRV检测冻干试剂形式。该制剂与简化的RNA释放方案相结合，支持双重读值模式：使用便携式蓝光成像仪进行可视化判读，或使用紧凑型手持设备进行实时荧光监测，使得无需复杂仪器即可解读结果。

2. 材料与方法

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  2.1. 病毒毒株
  研究中使用了包括MDRV在内的多种水禽病毒毒株，所有毒株均分离自福建省农业科学院畜牧兽医研究所并保存。
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  2.2. RNA分子标准品的制备
  MDRV毒株MW9710的σC基因（835 bp）被扩增、克隆并体外转录合成RNA。最终RNA标准品浓度为1.03 × 10¹⁰拷贝/μL，并制备了从1.03 × 10⁷到1.03 × 10⁰拷贝/μL的10倍系列稀释液。
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  2.3. MDRV检测引物和探针设计
  基于MDRV MW9710的σC基因序列，遵循RAA设计指南，设计了三组引物和一个外切酶探针。
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  2.4. 最佳引物组合的筛选
  通过系统筛选，对三个正向引物和三个反向引物的所有可能组合进行了评估，基于扩增效率和特异性，最终选定了正向引物F479–506和反向引物R600–627作为最优引物对。
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  2.5. 实时RT-RAA反应条件的优化
  对关键反应参数，包括孵育温度和探针浓度进行了系统优化。结果表明，在39°C和100 nM探针浓度下，扩增效率和荧光信号最强。
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  2.6. 灵敏度和特异性评估
  使用系列稀释的RNA标准品评估了RT-RAA的分析灵敏度，其检测限（LoD）为1.03 × 10¹拷贝/μL。使用多种常见水禽病原体的核酸测试了特异性，结果显示仅MDRV样本有特异性扩增，无交叉反应。
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  2.7. 重复性和重现性分析
  通过批内和批间实验评估了检测方法的精密度。对于液体形式和冻干形式的RT-RAA，所有变异系数（CV）值均低于5%，表明方法具有高重复性和重现性。
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  2.8. 即用型冻干RT-RAA试剂的制备
  为便于现场部署和实现免冷藏储存运输，开发了一种双组分冻干RT-RAA系统，包括含引物和探针的酶冻干粉（试剂A）以及含缓冲液和醋酸镁的冻干混合物（试剂B）。
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  2.9. 即用型冻干RT-RAA试剂适用性评估
  使用从福建莆田和漳州六个农场采集的42份临床样本，评估了冻干RT-RAA检测的临床性能和现场适用性。采用快速裂解方案直接从组织匀浆中释放目标核酸，并在便携式等温荧光检测器中进行扩增。所有样本同时使用已建立的RT-qPCR方法进行平行测试比较。
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  2.10. 统计分析
  使用GraphPad Prism 8.0进行统计分析。计算了Cohen's kappa系数（κ）以评估冻干RT-RAA检测与RT-qPCR结果的一致性。

3. 结果与讨论

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  3.1. 实时RT-RAA检测引物的筛选
  通过两步系统筛选，最终确定正向引物F479–506和反向引物R600–627的组合为最佳引物对，该组合在低模板浓度下也表现出优异的动力学和敏感性。

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  3.2. 实时RT-RAA检测反应条件的优化
  通过系统优化，确定最佳探针浓度为100 nM，最佳反应温度为39°C，在此条件下获得了最早的信号出现时间和最高的荧光增量。

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  3.3. RT-RAA检测的灵敏度和特异性评估
  液体形式的RT-RAA检测限为1.03 × 10¹拷贝/μL，与RT-qPCR相当。成功冻干成即用型试剂后，检测限保持不变，未出现明显扩增动力学延迟。特异性测试表明，无论是液体形式、冻干形式还是便携式仪器，都只对MDRV样本有特异性扩增，对其他水禽病原体无交叉反应。此外，使用便携式蓝光成像仪进行视觉评估时，仅MDRV样本显示明亮的绿色荧光，进一步证实了该检测的高特异性和现场应用潜力。

1 拷贝/μL。(b) 实时荧光特异性分析，仅MDRV样本观察到特异性扩增。(c) 便携式蓝光成像仪下的视觉特异性，仅MDRV样本观察到明亮的绿色荧光。">

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  3.4. RT-RAA检测的分析重复性和重现性
  使用高浓度（1.03 × 10⁷拷贝/μL）和低浓度（1.03 × 10³拷贝/μL）的RNA标准品评估了精密度。对于液体形式和冻干形式的RT-RAA，批内和批间的变异系数（CV）均在1.36%至4.48%之间，远低于通常分子诊断可接受的5%阈值，证明了该方法具有出色的重复性和重现性。

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  3.5. 冻干RT-RAA检测的现场适用性评估
  使用42份临床样本，在模拟现场条件下评估了冻干RT-RAA检测的临床性能。与作为参考方法的RT-qPCR相比，实时荧光RT-RAA检测表现出极佳的诊断一致性，κ值为0.952（p < 0.001）。实时荧光RT-RAA的灵敏度为95.8%，特异性为100%，总一致率为97.6%。当使用蓝光成像仪进行视觉判读时，灵敏度为83.3%，特异性仍为100%。视觉判读灵敏度较低的原因是，对于病毒载量低（RT-qPCR循环阈值Ct > 35）的样本，人眼难以区分微弱的阳性荧光与背景。尽管如此，无假阳性结果和冻干形式的操作简便性使其非常适合现场部署。

4. 结论

本研究成功开发了一种用于快速现场检测MDRV的冻干型实时RT-RAA检测方法。该方法在20分钟内实现了1.03 × 10¹拷贝/μL的检测限，灵敏度与RT-qPCR相当，但出结果时间显著缩短。该方法表现出高特异性，并成功冻干成即用型试剂，这是首个报道的用于MDRV检测的冻干型RT-RAA方法。临床验证进一步证实了其与参考RT-qPCR方法的优异一致性。这种稳健、便携且用户友好的检测方法为MDRV的现场诊断和主动监测，特别是在欠发达地区，提供了一个强大的工具。成功的冻干是实现免仪器检测的关键一步，但需要进一步验证试剂长期稳定性。

资金来源

本研究由福建省自然科学基金（项目号2025J011234）、福建省公益项目（项目号2023R1024002、2024R1025003、2025R1024001）和福建省农业科学院“5511”协同创新项目（项目号XTCXGC2021018和XTCXGC2021012）资助。

利益冲突

作者声明无利益冲突。