《iMeta》：Curcuminoids amplify host innate antiviral immunity via the CRYAB-RBM26 axis in viral infection
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本研究揭示了姜黄素（CUR）和去甲氧基姜黄素（DMC）通过上调分子伴侣CRYAB（αB-结晶蛋白）并稳定其下游靶点RBM26，精细调控I型干扰素（IFN-I）信号通路诱导与效应阶段，从而抑制肠道病毒D68（EV-D68）复制的全新机制。该轴心通过RBM26依赖的方式激活mtDNA-cGAS-STING通路，并重塑宿主核苷酸代谢，为开发基于宿主靶向的广谱抗病毒药物提供了关键理论依据。
内容归纳总结
姜黄素类化合物通过CRYAB-RBM26轴增强宿主固有抗病毒免疫的机制研究
摘要
姜黄素类化合物，包括姜黄素（CUR）和去甲氧基姜黄素（DMC），以其抗病毒特性而闻名，但其潜在的抗病毒靶点尚不清楚，与I型干扰素（IFN-I）信号通路的关系也未被完全阐明。本研究探索了DMC和CUR在EV-D68感染小鼠模型中对IFN-I通路的调节作用，并采用多组学分析来识别关键药物靶点及其相互作用网络。研究发现，DMC在光、温度和pH变化下表现出比CUR更好的理化稳定性。在体外和新生小鼠模型中，DMC和CUR通过抑制病毒2A基因表达和促炎细胞因子的释放，有效抑制了EV-D68的复制。这两种化合物都能上调分子伴侣CRYAB，CRYAB在EV-D68感染期间转位到细胞核，并作为宿主代谢和抗病毒免疫的中心调节因子。进一步的多组学分析表明，CRYAB过表达抑制了嘌呤代谢并上调了干扰素刺激基因（ISGs）。蛋白质组学分析将RBM26鉴定为关键的CRYAB相互作用靶点。CRYAB通过抑制病毒诱导的泛素化来稳定RBM26，从而增强IFN-I反应。DMC和CUR通过RBM26激活mtDNA-cGAS-STING通路，刺激下游信号传导和抗病毒效应。RBM26重构改变了胞苷/尿苷单磷酸激酶2（CMPK2）的剪接，导致核苷酸周转增加和胞苷水平降低，从而损害病毒复制。DMC/CUR处理或CRYAB过表达同样降低了细胞内胞苷和尿苷水平，增强了抗病毒活性。此外，DMC/CUR以RBM26依赖的方式恢复了EV-D68感染抑制的mtDNA水平，刺激cGAS介导的cGAMP产生，并激活STING-TBK1-IRF3轴。这些发现不仅阐明了姜黄素类化合物抗病毒作用的分子机制，也突出了其作为宿主导向抗病毒药物的治疗潜力。
引言
姜黄是南亚和中东菜肴中的传统香料和着色剂，含有姜黄素类化合物，如姜黄素、去甲氧基姜黄素和双去甲氧基姜黄素。姜黄素具有广泛的治疗潜力和多种生物活性，包括抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗菌、抗病毒和神经保护作用。先前，我们使用透明质酸修饰的姜黄素基纳米药物来促进糖尿病伤口愈合。据报道，CUR通过抑制复制或破坏病毒-宿主相互作用来抑制多种病毒感染，但其水溶性差和pH不稳定性导致其快速降解为无活性产物。DMC同样具有广泛的药理潜力，包括抗高血压、抗疟疾、抗病毒和抗菌作用。由于其芳香环上缺少一个甲氧基，DMC在室温下的水溶性更高，并且在生理条件下比CUR表现出更高的稳定性和生物活性。然而，DMC保留了CUR的主链结构，并对多种病毒表现出抗病毒活性，包括抑制病毒包膜糖蛋白的构象变化，这些变化有助于病毒附着到宿主细胞膜。
先前的研究表明，DMC显著增强I型干扰素（IFN-I）反应并上调干扰素刺激基因（ISGs）的表达。同样，另一项研究证明CUR可以增强I型IFN反应。然而，这是否代表了CUR和DMC共有的共同抗病毒机制尚不清楚。阐明这些潜在机制对于推进姜黄素类药物的临床开发和拓宽其在生物医学研究中的潜在应用至关重要。肠道病毒D68（EV-D68）是小核糖核酸病毒科的成员，是一种无包膜的正链单链RNA病毒。EV-D68主要引起呼吸道疾病，特别是在免疫功能低下的人群中，如儿童和老年人。此外，感染可导致神经系统并发症，包括急性弛缓性脊髓炎，其早期症状通常包括头痛、颈部及背部僵硬或疼痛。在更严重的情况下，病情可能发展为神经功能障碍和肌肉无力。目前，尚无批准的针对EV-D68感染的抗病毒疗法或疫苗。
因此，本研究采用比较分析来评估它们的理化特性和不同的细胞反应。利用蛋白质组学分析和分子对接来识别与CUR和DMC抗病毒活性相关的中心枢纽靶点。建立了由这些靶点调控的蛋白质库，并进一步整合代谢组学分析来描绘两种化合物调控的共同代谢途径。在综合的药物-靶点-代谢途径网络基础上，本研究阐明了姜黄素类化合物在病毒感染期间调控宿主代谢重编程的机制。这些发现为理解姜黄素类化合物与宿主抗病毒反应之间的相互作用提供了新的见解，弥补了关于基于天然产物的宿主靶向通路调控对抗RNA病毒感染的知识空白。
结果
与CUR相比，DMC具有更好的结构稳定性和抗病毒效果
通过傅里叶变换红外光谱（FTIR）对CUR和DMC的结构特征进行了分析。结果表明，DMC的光谱缺少CUR中观察到的几个特征吸收峰，特别是在1150.6、1105.5和1423.4 cm-1处。这是因为与DMC相比，CUR的苯环上多了一个-OCH3基团，这产生了CUR中观察到的特征吸收峰，特别是在1150.6 cm-1（CUR中-OCH3的C-O伸缩振动）、1105.5 cm-1（CUR中苯环的C-O伸缩振动）和1423.4 cm-1（CUR中-OCH3的C-H弯曲振动）。接下来，评估了两种化合物在不同环境条件下的稳定性，包括不同温度、光照时间和pH值。与CUR相比，DMC表现出显著更高的稳定性，在长时间光照（>50分钟）、强酸性（pH<3）和碱性（pH>8）条件以及温度超过30°C时表现出更好的抗降解能力。这些结果表明，DMC在极端条件下比CUR更稳定。
为了进一步研究CUR和DMC的抗病毒活性，我们使用出生24小时内感染EV-D68的新生BALB/c小鼠模型。根据麻痹评分和存活率，DMC即使在低剂量下也表现出有效的抗病毒活性，且具有剂量非依赖性保护作用，而CUR仅在高剂量下显示出显著的抗病毒效果。体重分析显示，与对照组相比，EV-D68感染导致感染小鼠生长显著迟缓。DMC和CUR治疗均有效缓解了病毒感染引起的生长抑制，尽管CUR需要比DMC更高的有效浓度。脑、肺和肝组织的组织学分析显示，CUR（HD）和DMC（MD）组炎症减轻，且DMC（MD）效果更显著。值得注意的是，大脑和肺部的炎症比肝脏和脾脏更明显。因此，我们评估了脑和肺组织中促炎细胞因子（IL-1β、IL-6和TNF-α）的水平。在同等药物浓度下，只有DMC显著降低了细胞因子水平，而CUR轻微降低了细胞因子水平。
EV-D68 2A蛋白与宿主细胞翻译机制相互作用以促进病毒基因组复制。因此，我们通过RT-qPCR定量了肺和脑组织中病毒2A基因的转录水平。与DMSO相比，DMC显著降低了2A基因表达，而在相同条件下，CUR仅表现出微弱且不显著的抑制作用。总体而言，这些数据凸显了DMC比CUR具有更好的稳定性和抗病毒效果。
DMC和CUR对EV-D68的抗病毒作用与增强的先天免疫反应和CRYAB表达相关
在感染EV-D68的横纹肌肉瘤细胞（RD细胞）中进一步评估了这些化合物的细胞毒性和抗病毒效果。DMC显示出比CUR略高的细胞毒性，但更有效地抑制了病毒2A基因的表达。
尽管CUR和DMC的抗病毒有效浓度不同，但两种化合物都能有效抑制病毒。进行了RNA-seq分析以识别两种药物在EV-D68感染期间调控的潜在共同靶点，揭示了两个治疗组之间共享的2282个上调基因和1996个下调基因。Reactome通路富集分析显示，上调基因与基因表达、细胞应激反应、干扰素信号传导和ER-吞噬体通路相关，而下调基因主要与DNA链延伸过程相关。先天免疫基因的热图分析显示，IFIH1、OAS1、IFITM3、IFNA1和OAS2在CUR和DMC治疗组中均上调。在共享的上调基因中，DMC处理后，CRYAB在RD-EV-D68和HepG2-HBV模型中持续增加。RT-qPCR证实，在RD细胞中，DMC引起的CRYAB mRNA上调显著大于CUR。放线菌酮（CHX）追踪实验表明，与阳性对照MG132相比，DMC/CUR没有显著影响CRYAB蛋白的稳定性。此外，姜黄素已被证明可调节HSF1活性，诱导其核转位并与DNA结合以激活HSPs的表达。与DMC/CUR单独处理相比，添加HSF1抑制剂显著下调了CRYAB转录，表明DMC/CUR对CRYAB的上调是HSF1依赖性的。此外，分子对接结果显示，DMC和CUR都强烈结合HSF1蛋白。在HepG2-HBV感染模型中观察到类似的转录组反应。分子对接预测了CUR和DMC与CRYAB的结合亲和力，DMC与更多的残基相互作用。然而，免疫荧光（IF）分析表明，两种化合物都没有改变CRYAB的亚细胞定位。与sh-NC相比，在CUR或DMC处理的RD细胞中，shRNA介导的CRYAB耗竭导致病毒2A基因表达增加，表明CRYAB确实功能性地参与了两种姜黄素类化合物的抗病毒活性。
CRYAB在EV-D68感染期间转位到细胞核并调节核苷酸代谢
免疫荧光揭示了CRYAB在EV-D68感染期间的细胞内重新分布。CRYAB从在细胞质中弥散分布，转变为聚集，部分核转位，最后完全进入细胞核，并伴有初始的核分裂。这些发现表明CRYAB可能通过聚集和潜在的核相互作用发挥功能。在线工具未识别到经典的核定位信号序列。与EV-D68感染组相比，用importin-β抑制剂处理导致CRYAB定位在细胞质，阻止其进入细胞核。免疫共沉淀结果也表明，在EV-D68感染后，CRYAB与importin-β强烈相互作用，而在模拟组中未检测到相互作用。此外，在剂量依赖性过表达CRYAB后，EV-D68感染后细胞呈现减少的细胞病变效应，胞质空泡化减少，细胞死亡水平降低。还观察到深色的核点，表明核固缩。透射电子显微镜揭示了明显的超微结构差异。在载体转染的细胞中，细胞核保持完整的核仁和核膜，胞质中的病毒样囊泡被线粒体包围。CRYAB过表达后，细胞核分裂，颗粒状结构在核周积累。
为了探索CRYAB核质转运的机制，在CUR和DMC处理后进行了代谢组学分析。两种化合物显著改变了氨基酸和核苷酸代谢途径。差异丰度代谢物的比较分析显示，两个治疗组中核酸相关代谢物的比例都很高。同样，与载体对照相比，CRYAB过表达显著调节了嘌呤和核苷酸代谢，并且CRYAB过表达上调了抗病毒相关通路和胞质DNA感应通路。CRYAB调控的差异表达蛋白的EggNOG功能富集分析显示，上调的DEPs主要与转录相关，而下调的DEPs则在能量产生/转换以及脂质转运和代谢方面富集。此外，CRYAB组的整合蛋白质组学-代谢组学分析证实了嘌呤和核苷酸代谢通路的富集。
多组学分析揭示RBM26是CRYAB驱动EV-D68诱导的免疫和代谢反应中宿主蛋白网络重塑的假定效应因子
为了阐明CRYAB调节核酸代谢的分子机制，我们进行了结合蛋白质组学、翻译后修饰分析和免疫沉淀-质谱的综合分析。总共鉴定了29个与CRYAB相互作用的上调DEPs，包括OAS1、IFNAR1和IFIT1，以及16个下调的DEPs，如DHFR、VTN和NT5DC2。
KEGG通路富集分析显示，上调的蛋白质及其相互作用物主要参与内吞作用和抗原加工/呈递通路，而下调的蛋白质则在代谢通路中富集。通过iPTH 3.0的进一步通路分析表明，下调的蛋白质主要与脂质和能量代谢相关，而上调的蛋白质及其相互作用物则在核酸代谢中富集。
EV-D68感染的RD细胞的蛋白质组学和转录组学分析显示，与载体对照细胞相比，CRYAB过表达显著上调了先天免疫基因的表达。通过STRING生成并通过Cytoscape可视化的蛋白质-蛋白质相互作用网络突出了hub-up-IP和hub-down-IP簇内的复杂关联。
与从STRING数据库参考预测的相互作用相比，使用ClusPro2.0进行的分子对接显示，CRYAB基于更低的能量分数与两个蛋白质簇表现出更强的结合亲和力。LigPlot+分析进一步显示，CRYAB与其实验鉴定的伙伴形成了比STRING预测的更广泛的氢键和疏水相互作用。值得注意的是，RBM26表现出与CRYAB的高亲和力结合，涉及28个残基的疏水相互作用和37个残基的氢键结合。
PTM数据的Reactome通路富集显示，磷酸化和泛素化蛋白质在与代谢、蛋白质稳态、免疫反应和RNA加工相关的通路中富集。蛋白质组学和PTM数据的整合表明，CRYAB过表达增加了基础RBM26蛋白水平，同时显著降低了RBM26的磷酸化和泛素化，表明CRYAB可能通过直接结合抑制其泛素介导的降解来稳定RBM26。
CRYAB通过抑制病毒诱导的泛素化来稳定RBM26并协同增强抗病毒免疫
分子动力学模拟显示，CRYAB-RBM26复合物在前30纳秒内经历了显著波动，但随后趋于稳定。分子间氢键数量始终保持在20个以上，并增加到80个，反映了强大而持久的相互作用。通过MM/GBSA计算的结合自由能保持在约-145.93 kJ/mol，表明界面稳定且能量有利。吉布斯自由能景观分析证实了这种稳定性，揭示了多个具有密集氢键和互补疏水接触的低能量构象。对接研究进一步显示，RBM26几乎占据了CRYAB的整个表面，为其高亲和力、多状态相互作用提供了结构基础。
免疫共沉淀证实，EV-D68感染增强了CRYAB-RBM26的相互作用。Sh-CRYAB增加了RBM26的泛素化，而外源性CRYAB以剂量依赖的方式降低了RBM26的泛素化。根据分子对接结果，根据CRYAB的功能域特征构建了一系列点突变载体，免疫共沉淀结果显示A1和A2突变体失去了与RBM26结合的能力，并且这些位点位于CRYAB的结晶蛋白结构域。接下来，RBM26的泛素化表明，与野生型CRYAB相比，A1和A2突变体表现出微弱的抑制作用，而RBM26在B1和B2组中保持低水平的泛素化。
测序结果显示，RBM26的特异性泛素化位点可能是K529和K538。我们随后构建了RBM26 K位点突变质粒，结果显示K529和K538对RBM26的泛素化都是必需的。鉴于K48连接的多聚泛素化是介导蛋白酶体降解的经典标志，我们的结果显示，与野生型Ub质粒相比，Ub-K48突变质粒组中RBM26的泛素化水平极低，与空白对照组相似，表明EV-D68感染诱导的RBM26泛素化依赖于K48连接的多聚泛素化。CHX追踪实验表明，CRYAB减轻了病毒诱导的RBM26降解，从而保持了RBM26蛋白的稳定性。值得注意的是，在EV-D68感染时，CRYAB从细胞质转位到细胞核，导致与RBM26几乎完全的核共定位。
RBM26的过表达显著降低了病毒2A基因的转录水平。转录组学分析显示，被RBM26单独或与CRYAB组合恢复的基因在与细胞因子信号传导、干扰素信号传导和更广泛的干扰素反应相关的通路中显著富集。值得注意的是，RBM26和CRYAB的共表达导致免疫相关通路中最显著的富集。这包括协同上调关键的抗病毒效应因子，如STAT2、GBP5、IFIT1B和MX1。基因集变异分析显示，在共同恢复组中，病毒周期负调控和抗原呈递通路富集，而RBM26的敲低则有利于与病毒复制和受损mRNA调控相关的通路。
为了进一步探索RBM26调控的靶基因，我们进行了维恩分析，确定了11个在RBM26沉默后上调并在RBM26重新表达后下调的基因。此外，发现7个基因在RBM26沉默后下调并在RBM26重新表达后上调。这些基因被发现形成一个交互网络，暗示了潜在的功能关系。总之，这些结果表明，CRYAB不仅通过抑制病毒诱导的泛素化来稳定RBM26，而且还协同放大RBM26驱动的、对先天抗病毒免疫至关重要的转录程序。
CRYAB增强RBM26介导的选择性剪接重编程
RBM26是一种已知调节mRNA剪接的RNA结合蛋白，对选择性剪接事件具有广泛影响。RBM26的过表达显著增加了全局AS活性，主要是通过诱导外显子跳跃事件。ΔPSI分析揭示了不同的剪接模式：RBM26过表达促进了SE型变化，而RBM26敲低主要影响了5'端可变剪接事件。值得注意的是，RBM26和CRYAB的联合过表达引发了最多样化的AS谱，包括互斥外显子和内含子保留。
比较AS分析显示，580个基因在各组中普遍受到影响，其中RBM26敲低组有195个独特调控基因，RBM26+CRYAB共同恢复组有1423个独特事件。这些AS基因的表达谱分析显示，RBM26和RBM26+CRYAB组的表达离散度和平均表达量增加，呈现RC > SiR > R的层次趋势。基因集富集分析将RBM26敲低特异性基因与蛋白质二聚化活性联系起来，而RBM26+CRYAB特异性AS基因则在与激酶结
