《HUMAN MUTATION》：P4HA2 Participates in Pathogenesis of Refractive Error by Regulating Collagen Posttranslational Modification and Extracellular Matrix Balance
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本研究发现，脯氨酰-4-羟化酶II（P4HA2）基因的缺失，会降低胶原蛋白中特定脯氨酸残基的羟化水平，进而削弱胶原纤维的热稳定性，导致其在巩膜和角膜中发生时间依赖性的排列紊乱和密度降低。同时，细胞外基质（ECM）组分失衡（如胶原蛋白I减少、纤连蛋白增加），最终引发光通路改变和视觉功能障碍。这为理解高度近视（HM）的遗传与分子机制提供了新的视角。
1. 引言
近视，特别是高度近视（HM），已成为一种日益普遍的全球性视力问题。据预测，其患病率将持续攀升，其中约20%的病例属于HM，被定义为屈光度小于-6.0 D。HM的特征是眼轴（AL）过度伸长、巩膜变薄和视力进行性下降，它已是东亚地区不可逆性失明的主要原因。其病因复杂，涉及环境和遗传因素的共同作用。近年来的研究已发现包括BSG、P4HA2、LEPREL1、ZNF644、SLC39A5、VIPR2和ARR3在内的多个与HM相关的基因。针对HM发病机制的研究主要集中在细胞外基质（ECM）的重塑与退化，特别是巩膜区域。胶原蛋白翻译后羟化修饰相关基因（如P4HA2和LEPREL1）的突变已在HM家系中被发现。本研究聚焦于P4HA2基因，通过在动物和细胞模型中进行功能研究，旨在阐明其在HM发病过程中的作用机制。
2. 材料与方法
研究构建了P4HA2基因敲除的C57BL/6小鼠（P4ha2?/?）和P4HA2敲除的HEK293细胞系。通过水体视觉测试评估小鼠的视敏度。利用光学相干断层扫描（OCT）和偏心红外屈光仪（EIR）测量了小鼠在不同周龄（4周和8周）时的一系列眼部生物参数，包括角膜厚度、前房深度（ACD）、晶状体厚度（LT）、玻璃体腔深度（VCD）、眼轴长度（AL）和角膜曲率半径。通过视网膜电图（ERG）和OCT评估了视网膜功能与结构。利用透射电子显微镜（TEM）观察了巩膜和角膜胶原纤维的超微结构。通过热稳定性试验和液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析了胶原蛋白的热稳定性及其脯氨酸羟化水平（4Hyp）。使用免疫印迹和免疫荧光技术检测了角膜、巩膜组织及细胞中胶原蛋白I和纤连蛋白的表达水平与定位。
3. 结果
3.1. P4ha2?/?小鼠表现出视觉功能受损
与野生型（WT）小鼠相比，8周龄的P4ha2?/?小鼠视敏度显著下降（p < 0.01），其中位数视敏度为0.3 cpd，而野生型为0.47 cpd。
3.2. P4ha2?/?小鼠表现出异常的眼部结构
通过OCT监测发现，与WT小鼠相比，P4ha2?/?小鼠在4周龄时已表现出角膜曲率半径显著减小（p < 0.01）和玻璃体腔深度增加（p < 0.05）。到8周龄时，这种趋势更为明显，其前房深度更深（p < 0.01）且玻璃体腔长度进一步增加（p < 0.0001）。尽管眼轴长度在两组间未见统计学差异，但通过EIR测量发现，8周龄KO小鼠的角膜中央屈光度更低。ERG测试和视网膜结构分析则表明，P4ha2?/?小鼠的视网膜功能和结构相对完好。
3.3. P4ha2?/?小鼠巩膜和角膜中的胶原含量呈现进行性减少
通过TEM对8周龄和16周龄小鼠眼球进行超微结构观察发现，与WT小鼠相比，P4ha2?/?小鼠角膜的胶原纤维排列紊乱，巩膜外层胶原纤维更稀疏。在16周龄时，这种胶原纤维排列紊乱和稀疏的现象更为显著，其纤维数量（密度）和平均直径均显著减小。蛋白质印迹分析进一步显示，在8周龄P4ha2?/?小鼠的角膜和巩膜组织中，胶原蛋白I的表达水平降低，而纤连蛋白的表达水平升高，表明ECM成分失衡。
3.4. 由于非(GPP)n位点P181、P182、P197和P200的脯氨酸羟化缺失，胶原热稳定性降低
对从小鼠角膜中提取的胶原蛋白进行热稳定性测试发现，P4ha2?/?小鼠来源的胶原在37°C时即发生降解，而对照组胶原在38°C时仍保持稳定，这表明P4HA2缺失导致胶原热稳定性下降。LC-MS/MS质谱分析揭示了羟化水平变化的具体位点。在胶原蛋白I的α1链中，对稳定性至关重要的保守(GPP)n重复序列（如位点P1169， P1172， P1175， P1178）的羟化水平并未改变。然而，在非(GPP)n的其他位点，特别是P181、P182、P197和P200，其4Hyp水平显著降低。这种不均衡的羟化缺失，尤其是EPG序列（如P197和P200）位点的完全羟化缺失，是导致胶原热稳定性下降的主要原因。
3.5. 细胞外基质相关蛋白在脯氨酰-4-羟化酶II缺失的细胞中表现出失衡和积累
为了探究P4HA2缺失导致胶原纤维稀疏的机制，研究构建了P4HA2敲除的HEK293细胞系。蛋白质印迹结果显示，在该细胞中，胶原蛋白I表达减少，而纤连蛋白表达增加，这与在体组织中的发现一致。同时，细胞培养基上清液中胶原蛋白I的C-端前肽含量未变，表明胶原蛋白I水平的下降并非由其分泌减少引起，而是更多地源于其降解。免疫荧光实验进一步发现，在P4HA2敲除细胞中，胶原蛋白I异常积聚在内质网中。这种积累与胶原转运蛋白复合体组分KLHL12无共定位，提示该现象可能并非由转运障碍导致，而更可能与未充分羟化、稳定性差的胶原在内质网中被降解有关。
4. 讨论
本研究首次揭示了P4HA2基因敲除小鼠表现出与HM患者相似的视功能损害表型。综合各项检测结果，P4ha2?/?小鼠表现出异常的眼部光学结构，但其视网膜结构和功能正常。超微结构分析显示，其巩膜和角膜胶原纤维存在排列紊乱、稀疏和时间依赖性的退化。
胶原蛋白中含有约22%的脯氨酸或羟脯氨酸，这对稳定胶原三螺旋结构至关重要。其中，由脯氨酰-4-羟化酶催化的、位于Gly-Xaa-Yaa重复序列中Y位的脯氨酸羟化，能显著提升胶原的热稳定性。本研究发现，在P4ha2?/?小鼠中，胶原蛋白I的α1链上关键的(GPP)n重复序列羟化水平得以保留，这解释了为何该小鼠未出现与骨骼发育相关的严重表型（如成骨不全）。然而，在其他非(GPP)n位点，特别是EPG序列（P197和P200），其羟化几乎完全缺失，这直接导致了胶原热稳定性的下降，使其在生理温度下易于降解，这可能是HM患者视力进行性下降的潜在分子基础。
此外，研究观察到P4ha2?/?小鼠和P4HA2敲除细胞中，均存在ECM组分的失衡：胶原蛋白I减少，纤连蛋白增加。这种组分的改变会影响组织的折射率。已知人角膜的折射率（1.401至1.373）主要受胶原蛋白I（折射率约1.43）的影响。胶原蛋白I的减少和纤连蛋白的增加，结合前房深度变浅、玻璃体腔加深等结构改变，共同导致了光通路的变化，从而引发屈光不正。这一机制也解释了为何在一些HM基因编辑小鼠模型（如Vipr2?/?小鼠）和部分HM患者（如Cohen综合征患者）中，即使眼轴长度未显著变化，仍会出现严重的屈光不正症状。
总之，P4HA2通过调节胶原蛋白的翻译后羟化修饰，影响其热稳定性和降解，进而导致巩膜和角膜ECM成分失衡（胶原减少、纤连蛋白增加），改变眼球屈光系统的光学特性与光路，最终参与高度近视相关屈光不正的发病及其进行性恶化过程。本研究阐明了P4HA2在HM中的新机制，为理解遗传性近视的病理生理学提供了重要依据。
