《HUMAN MUTATION》：Analyses of ATP7B mRNA in Nasopharyngeal Swab Samples Increase Yields of Wilson Disease Molecular Genetic Diagnostics
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这篇研究提出了肝豆状核变性(WD)分子诊断的新策略。针对ATP7B基因低频同义变异等“意义不明”变异的检测难题，研究团队发现并证实了鼻咽拭子作为非侵入性替代组织样本的可行性，其ATP7B mRNA表达谱与肝脏相似。通过长读长纳米孔测序分析cDNA扩增子，该方法成功揭示了四例常规遗传诊断未能确诊的患者中由同义或无义变异导致的异常剪接事件，明确了双等位基因致病性变异，从而获得了确诊。这项创新技术为WD及其他受限于组织特异性表达的遗传病的精准诊断提供了新途径。
1. 引言
肝豆状核变性(WD， OMIM 606882)是一种罕见的常染色体隐性遗传病，由铜转运蛋白基因ATP7B的双等位基因致病性变异引起，导致铜在肝脏和大脑等器官中异常蓄积。其诊断具有挑战性，临床表现多样，包括肝脏疾病（肝炎、肝硬化、急性肝衰竭）、神经精神症状以及肾脏、骨关节、内分泌或心脏病变。目前的WD诊断算法依赖于莱比锡评分，该评分结合了临床评估、Kayser-Fleischer角膜环、生化指标（低血清铜蓝蛋白、高非铜蓝蛋白结合铜、尿铜排泄增加和肝铜含量增加）以及分子遗传学分析。
从遗传学角度看，WD由ATP7B基因的致病性变异导致，包括单核苷酸变异(SNV)、小片段插入缺失、由Alu重复元件介导的大片段基因内缺失以及影响mRNA合成/加工的非编码变异。常规的DNA测序通常从外周血白细胞(WBCs)提取基因组DNA(gDNA)进行，可以识别出大多数编码区变异。然而，标准遗传诊断在约3%–20%的WD患者中仍无法得出结论，部分原因是存在意义不明确或致病性分类冲突的变异，包括可能影响mRNA剪接的同义变异。
验证这些变异致病性的现有方法，例如侵入性肝活检取样、成纤维细胞mRNA分析、白细胞中进行极低表达量的ATP7B检测或迷你基因剪接测定，均存在各自的局限性。为了克服这些限制，本研究致力于寻找一种易于获取、能充分表达ATP7B mRNA、可用于体内评估潜在剪接变异影响的临床样本。
2. 材料与方法
本研究纳入了四名遗传诊断不完整的WD患者(P1–P4)，其诊断基于特征性的临床和生化表现以及莱比锡评分超过4分。患者临床特征包括不同年龄发病，表现为神经症状或意外发现的肝功能异常，伴有铜蓝蛋白降低、尿铜排泄增加及肝脏病理改变。
研究获得了查尔斯大学第一医学院伦理委员会的批准。常规方法：采用Sanger测序和外显子连接依赖探针扩增(MLPA)技术对ATP7B基因进行检测。
创新的取样技术：采用无菌尼龙拭子收集鼻咽拭子样本。将拭子平行于上颚轻轻插入鼻孔，直至到达鼻咽穹窿，旋转数次以最大程度收集鼻咽黏膜细胞，采样后立即浸入RLT缓冲液中保存。
转录组分析：从对照个体的鼻咽拭子、肝脏、成纤维细胞和WBCs中分离总RNA，构建链特异性rRNA去除文库，并进行Illumina平台测序，以评估ATP7B表达水平和转录本分布。
扩增子构建与分析：从鼻咽拭子总RNA反转录得到cDNA，利用特定引物对ATP7B cDNA中跨越外显子3至21的区域进行长片段PCR(LR-PCR)扩增，获得3130 bp的ATP7B_E3-E21产物。同时，也从gDNA中扩增了跨越内含子4至9的ATP7B_I4-I9区域。这些扩增子产物均通过磁珠纯化。
测序技术应用：使用牛津纳米孔平台对ATP7B_E3-E21 cDNA扩增子进行长读长测序；使用PacBio Sequel I系统对ATP7B_I4-I9 gDNA扩增子进行长读长测序。测序数据经过比对、处理和可视化分析。
生物信息学预测：使用人类剪接查找器专业版(HSF Pro)分析了所鉴定同义变异及无义变异对剪接调控元件（如外显子剪接增强子ESE和外显子剪接沉默子ESS）的影响。
等位基因及异构体定量：基于测序数据，根据是否包含完整外显子等特征对序列读数进行分组，计算ATP7B转录本异构体的比例，并追踪等位基因特异性变异以确定相性和计算等位基因表达比例。
3. 结果
初始不完整的遗传诊断：常规Sanger测序在四位患者中均发现了一个已报道的致病性等位基因（等位基因1）和另一个同义变异（等位基因2）。这些同义变异在ClinVar数据库中被标注为“致病性分类冲突”或“可能良性”，在人群数据库gnomAD中频率极低或为零。其中P1患者的变相未知，而P2、P3和P4患者通过父母传递分析确定了变异呈反式排列。体外剪接预测分析表明，同义变异c.1488C>T (p.(Gly496=))、c.2292C>T (p.(Phe764=))和c.2241C>T (p.(Ile747=))可能影响ESE和ESS基序，导致ATP7B mRNA剪接异常，而无义变异c.2336G>A (p.(Trp779Ter))则未影响外显子剪接比例(ESR)谱
鼻咽拭子中ATP7B mRNA高表达：RNA测序数据显示，ATP7B mRNA在对照鼻咽拭子中丰度最高，TPM（每百万转录本）值为39.5，高于肝脏(TPM = 7.4)、皮肤成纤维细胞(TPM = 3.1)和可忽略不计的WBCs (TPM = 0.3)。鼻咽拭子中的ATP7B mRNA谱与肝脏相似，主要由包含全部21个外显子的主要异构体(NM_000053.4)构成。研究在鼻咽拭子样本中独家鉴定出一个与常规外显子1丰度约1:1的新型替代外显子1b。肝脏和鼻咽拭子中的主要异构体（无论起始于外显子1或1b）约占所有ATP7B转录本的70%。
长读长测序确认患者诊断：对患者及对照的ATP7B_E3-E21扩增子进行纳米孔测序分析。在对照样本中，主要全长转录本约占62%，其次是缺乏外显子8(d8, ENST00000673772.1)的转录本（鼻咽拭子11%，肝脏15%），以及缺乏外显子6-7-8(d6d7d8)的转录本（鼻咽拭子6%，肝脏5%）
在患者分析中，这一方法揭示了由同义或无义变异导致的异常剪接，并明确了双等位基因致病性：
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P1患者：等位基因1(p.(Lys1248fs))转录本比例低(7%)，提示无义介导的mRNA衰变(NMD)。从等位基因2(p.(Phe764=))产生的转录本以外显子8跳跃为主(51% d8 和 21% d6d7d8)。总体上，仅3%的转录本是全长且可能编码功能性蛋白质的。
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P2患者：31%的全长转录本来自等位基因1(p.His1069Gln)。从等位基因2(p.(Phe764=))产生了显著增多的d8和d6d7d8转录本(24%和15%)。总体全长转录本仅占2%。
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P3患者：等位基因1(p.(Trp779Ter))和等位基因2(p.(Ile747=))均主要产生d8和d6d7d8转录本。总体上，全长功能性转录本仅占13%。
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P4患者：等位基因表达比例约为1:1。等位基因1携带p.His1069Gln变异。而从等位基因2(p.(Gly496=))产生的转录本中，绝大多数携带了外显子3的部分缺失(del3_57b)。
通过长读长测序，研究者排除了P1-P3患者内含子中罕见变异对剪接的额外影响，并直接证明了所有四位患者中发现的变异均呈反式排列，即符合复合杂合状态。这些剪接异常导致了功能性转录本比例极低，从而解释了患者的疾病表型。
4. 讨论
本研究的核心新发现是确定了ATP7B基因在鼻咽拭子样本中高表达。这一发现具有重要的诊断应用价值：利用鼻咽拭子样本进行长读长测序分析，能够有效地在体内验证变异（包括同义变异）对ATP7B mRNA合成和加工的影响。
最近，有研究提出“无感变异”这一新分类，强调那些通过影响剪接调控、基因表达或导致mRNA剪接缺陷的外显子替代。本研究中分析的ATP7B同义变异即属于此类。通过鼻咽拭子mRNA分析，研究者成功验证了p.(Phe764=)、p.(Ile747=)和p.(Gly496=)等“意义不明”变异的致病性影响。长读长测序分析不仅揭示了ATP7B转录本异构体的多样性及其比例，还可以轻松评估变异的相性（顺式或反式），这在父母无法提供样本进行遗传检测时尤为重要。
数据表明，鼻咽拭子中ATP7B的表达量甚至高于肝脏。两种组织中ATP7B转录本的总体构成和相对丰度相似。唯一的差异是在鼻咽拭子中独家发现了新型替代外显子1b。这可能反映了鼻咽黏膜细胞与肝细胞具有共同的发育起源。
在蛋白质层面，研究推测由p.(Phe764=)、p.(Ile747=)和p.(Trp779Ter)导致的外显子8框内跳跃(d8)，会导致合成的ATP7B蛋白缺乏对于转运功能和正确蛋白折叠至关重要的跨膜结构域。而P4患者中外显子3的部分缺失(del3_57b)则预计会编码缺失部分金属结合结构域5的ATP7B蛋白。
研究发现，ATP7B基因第5-9外显子区域本身就富含外显子跳跃事件（在对照中可高达25%的转录本）。但在患者中，所鉴定的同义和无义变异显著加剧了含有跳跃外显子转录本的比例。长读长测序显示，所有四位患者的鼻咽拭子中，能够翻译成功能性蛋白质的ATP7B转录本比例极低（最高不超过13%）。
目前已有针对WD患者（包括症状前个体）的螯合剂或锌盐等有效治疗方法。因此，验证ATP7B变异致病性的策略，不仅有助于补充干血斑ATP7B蛋白定量等其他诊断方法，方便受累家庭的遗传咨询，也能帮助识别可能从早期治疗中获益的个体。此外，ATP7B变异也被关联研究报道可能参与阿尔茨海默病等疾病的病理过程，或影响化疗反应/耐药性的级联效率。因此，有效评估ATP7B变异的影响，可能具有超越WD患者群体的社会医学意义。最后，鼻咽拭子材料也可能为其他受限于组织特异性表达模式单基因病的分子诊断提供相关基因转录本。
5. 结论
研究结果表明，通常在序列数据分析中被排除在外的同义变异，应谨慎看待，并被视为WD的潜在关键致病因素。对从易获取的鼻咽拭子样本中产生的ATP7B mRNA扩增子进行长读长测序，有助于识别剪接影响并确定变异相性。这一创新技术为提升肝豆状核变性的精准诊断效率提供了有力的新工具。
