《MEDIATORS OF INFLAMMATION》：Benzydamine Attenuates Matrix Metalloproteinase-9 Expression Through Inhibition of ERK MAPK in Activated Human Monocytic Cells Under Hyperglycemic Condition
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本篇综述研究了临床常用抗炎药苯达明（Benzydamine）在治疗糖尿病合并脓毒症相关并发症中的潜在新机制。文章核心发现是，在模拟高血糖环境的条件下，苯达明能显著抑制内毒素脂多糖（LPS）刺激人单核THP-1细胞产生基质金属蛋白酶-9（MMP-9），其作用机制是通过特异性抑制细胞外信号调节激酶（ERK）丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和核因子-κB（NF-κB）信号通路的活化，从而减少MMP-9的表达和明胶水解活性。这一发现揭示了苯达明在减轻高血糖相关内毒素血症中组织降解性炎症反应方面的新作用，为其拓展用于糖尿病并发症的抗炎治疗提供了理论基础。
引言：高血糖、脓毒症与MMP-9的复杂关系
脓毒症是一种危及生命的感染并发症，糖尿病患者一旦发生脓毒症，其死亡率显著升高。高血糖会创造一个加剧炎症的恶劣环境，导致包括基质金属蛋白酶（MMPs）在内的多种促炎分子水平升高，从而延长炎症反应。其中，基质金属蛋白酶-9（MMP-9）不仅在炎症性疾病发病中起关键作用，也是高血糖条件下（如脓毒症和牙周病）感染进展的关键介质。单核/巨噬细胞谱系通过释放MMPs在炎症重塑中扮演着至关重要的角色。脂多糖（LPS）作为内毒素，能够通过Toll样受体4（TLR-4）激活单核细胞，诱导MMP-9产生。肿瘤坏死因子-α（TNF-α）同样是MMP-9表达的关键诱导因子。因此，阐明能够抑制MMP-9的药物机制，对于预防高血糖相关内毒素血症下的组织降解和寻找抗炎治疗新靶点具有重要意义。
苯达明是一种临床上广泛用于治疗咽炎和牙周炎的非甾体抗炎药（NSAID），具有局部麻醉和镇痛特性。先前研究显示，苯达明在治疗脓毒症、减轻神经炎症和改善缺血性卒中损伤方面均表现出潜力。本研究旨在探究苯达明在高糖条件下，对LPS刺激的人单核THP-1细胞中MMP-9激活的抗基质降解作用及其机制。
材料与方法
研究使用了人单核白血病THP-1细胞系。细胞分别在正常葡萄糖（11 mM）和高葡萄糖（25 mM）的培养基中进行培养和处理。通过明胶酶谱法分析MMP-9介导的明胶水解活性，蛋白质印迹法检测MMP-9蛋白及信号通路蛋白（如磷酸化p38、JNK、ERK MAPK和p65 NF-κB）的表达。通过酶联免疫吸附试验测定金属蛋白酶组织抑制剂-1（TIMP-1）的水平。通过逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测MMP-9 mRNA的表达。通过共聚焦免疫荧光分析观察磷酸化ERK（pERK）的核转位情况。通过流式细胞术测定细胞表面TLR-4的表达。采用MTT法评估细胞活力。所有数据均进行统计学分析。
结果
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苯达明在正常及高糖条件下对LPS诱导的MMP-9的抑制作用：
在正常葡萄糖条件下，LPS刺激显著增加了THP-1细胞的MMP-9明胶水解活性和蛋白表达，而苯达明预处理能浓度依赖性地抑制这种增强作用。研究发现，高葡萄糖条件本身能加剧LPS诱导的MMP-9明胶水解活性。在此条件下，苯达明同样能显著且浓度依赖性地抑制LPS诱导的MMP-9明胶水解活性和蛋白表达。然而，ELISA检测发现，苯达明仅在高浓度（50 μM）时部分降低了TIMP-1的水平，表明其抑制MMP-9并非通过增加TIMP-1实现。细胞活力试验表明，50 μM苯达amine会部分降低细胞活力，但MMP-9活性被抑制至接近基线水平，说明其作用不单纯源于细胞毒性。在长期高糖条件下，苯达明同样表现出浓度依赖性的抑制效果。
- 2.
苯达明对TNF-α诱导的MMP-9的抑制作用：
由于LPS能显著诱导TNF-α产生，而TNF-α本身也可促进MMP-9表达，研究进一步评估了苯达明对TNF-α诱导的MMP-9激活的影响。在正常葡萄糖条件下，苯达明能浓度依赖性地抑制TNF-α诱导的MMP-9明胶水解活性、蛋白表达以及mRNA表达，表明其抑制作用发生在转录水平。
- 3.
苯达明对MAPK和NF-κB信号通路的影响：
在高糖条件下，LPS刺激显著增加了p38、JNK、ERK MAPK以及p65 NF-κB的磷酸化水平。有趣的是，苯达明预处理对LPS诱导的p38和JNK MAPK的磷酸化没有明显影响，但能显著抑制磷酸化p65（NF-κB激活的标志）和磷酸化ERK的表达。这一结果强烈提示，ERK MAPK可能是苯达明发挥抑制作用的关键靶点。
- 4.
苯达明对磷酸化ERK核转位的影响：
共聚焦免疫荧光分析显示，LPS刺激导致pERK从细胞质转位到细胞核，而苯达明（50 μM）能够抑制这种核转位。经典的ERK抑制剂U0126也表现出相同的抑制效果。明胶酶谱实验进一步证实，U0126能浓度依赖性地抑制LPS诱导的明胶水解活性，验证了ERK通路在其中的关键作用。
- 5.
苯达明对LPS诱导的表面TLR-4表达的影响：
LPS通过细胞表面受体TLR-4触发炎症反应。流式细胞术分析发现，在高糖条件下，LPS刺激显著上调了THP-1细胞表面TLR-4的表达。苯达明（50 μM）能显著抑制这种上调作用。同样，ERK抑制剂U0126也能有效降低表面TLR-4的表达，这与ERK信号参与TLR-4调控的报道一致。
- 6.
苯达明对COVID-19 S1蛋白诱导的MMP-9激活的影响：
补充实验表明，SARS-CoV-2刺突蛋白S1亚单位也能在高糖条件下刺激THP-1细胞产生MMP-9介导的明胶水解活性，而苯达明对此同样具有抑制作用，提示其抗炎作用可能对COVID-19相关的炎症并发症也有潜在意义。
讨论
本研究证实，高糖环境会加剧LPS诱导的单核细胞MMP-9表达。苯达明能够通过特异性抑制ERK MAPK和NF-κB信号通路的激活，来减轻这种增强的MMP-9表达和活化。苯达明对TNF-α诱导的MMP-9同样有效，且能抑制其mRNA转录，表明其作用涉及基因表达层面。研究还发现苯达明能下调LPS诱导的细胞表面TLR-4表达，这可能与其抑制ERK信号有关。
高血糖作为一种高渗状态，可能通过影响上游信号分子（如Ras或MEKK1/2）来增强ERK的活化，而苯达明可能作用于这些上游环节。此外，苯达明对COVID-19 S1蛋白诱导的MMP-9激活的抑制作用，为其在应对病毒相关细胞因子风暴和组织损伤方面的潜力提供了线索。
需要指出的是，本研究使用11 mM葡萄糖作为“正常”对照，虽略高于生理血糖浓度，但这是THP-1细胞标准培养基的浓度，已被广泛用于与更高糖条件的比较研究。
结论
总而言之，本研究阐明，苯达明主要通过抑制ERK MAPK信号通路，来减轻高糖条件下LPS激活的人单核THP-1细胞中MMP-9的表达和活化。鉴于苯达明对MMP-9的下调作用，这种具有双重功能（抗炎、镇痛）的经典非甾体抗炎药，值得在动物模型中进行进一步研究，或可作为治疗糖尿病内毒素血症相关组织降解效应的潜在药物。
